毛曉露，石小燕綜述；盧忠心，胡麗華審校

（1.武漢市中心醫(yī)院檢驗科，武漢430014；2.武漢市中心醫(yī)院中心實驗室，武漢430014；3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，武漢430022）

侵襲性真菌病（invasive fungal disease，IFD），又稱侵襲性真菌感染，是真菌侵入人體組織和血液，并在其中生長繁殖導致組織損害、器官功能障礙和炎癥反應的病理、生理過程。近年來，由于環(huán)境因素的危害和藥物因素影響（如免疫移植、腫瘤放化療、大劑量廣譜抗生素的長期使用、糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛應用等），造成了IFD的患病率和病死率均呈顯著上升趨勢。免疫力低下的IFD患者大多病情兇險，常無特征性臨床表現(xiàn)，易被原發(fā)病或繼發(fā)細菌、病毒感染掩蓋，且對傳統(tǒng)抗真菌藥物的敏感性降低，故臨床早期診斷非常困難，后期治療十分棘手。真菌感染的檢測技術，目前以人工鏡檢、培養(yǎng)和組織病理檢查等傳統(tǒng)方法分析為主，但這些方法檢測時間較長、敏感性較低且受主觀因素影響較大。因此，快速檢測此類病原菌是治療和改善預后的關鍵。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術具有快速、簡便、敏感性和特異性高等優(yōu)點，在一定程度上可以彌補傳統(tǒng)方法的不足。本文就其在IFD快速診斷的研究進展及臨床應用遠景進行綜述。

1 PCR技術在診斷曲霉病中的應用

由曲霉屬真菌感染引起的疾病包括過敏性支氣管肺曲菌病、肺曲霉球病和侵襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）。血液和肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）是臨床檢測的常規(guī)標本。最近研究表明，大量血清和BAL沉渣與少量血清和經(jīng)離心BAL的上清液相比，更容易檢出真菌病原體［1］。采用實時定量PCR檢測血液和BAL標本進行IA診斷分析有助于節(jié)省檢測時間，可在物種水平鑒定基礎上更有針對性地進行抗真菌藥物治療，具有較好的臨床應用價值，并建議對PCR技術進行標準化［2］。雖然PCR標準化有利于診斷性能的驗證，但仍存在一些問題，如DNA的提取效率提高至多少可以增加診斷的敏感性，哪類臨床標本更能有利于指導臨床診斷以及血中何種組分含有最多真菌DNA等。

2 PCR技術在診斷念珠菌病中的應用

念珠菌是人體黏膜最常見的共生菌，也是免疫功能低下患者感染最常見的真菌病原體。約50%的感染由白色念珠菌引起，其他幾種念珠菌也可引起侵襲性疾病，如近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、葡萄牙念珠菌等。由于念珠菌屬的基因決定了對不同抗真菌藥物敏感性有所不同，盡快正確鑒定念珠菌種屬以采取適當?shù)乃幬镏委煂μ岣吲R床療效和降低病死率非常重要。通過血培養(yǎng)檢測念珠菌的敏感性通常較低（大約為50%或更低），其他基于抗原、抗體和代謝物的念珠菌檢測技術都有各自的優(yōu)勢和價值，但缺乏特異性和敏感性。PCR檢測提供了一個快速診斷并正確鑒定念珠菌到達種屬水平的方法。念珠菌是口腔和上呼吸道的共生體，呼吸道標本可能被念珠菌污染。因此，從呼吸道標本分離出的念珠菌，包括支氣管鏡檢查和BAL（甚至標本保護刷）的試樣，在沒有病原菌入侵的活檢證據(jù)時不考慮診斷為IFD。在BAL中檢測到高水平的念珠菌可建議診斷為念珠菌性肺炎，盡管這種臨床實例非常罕見。血液標本由于最可能包含循環(huán)中完整有機體形式或細胞外形式的真菌DNA而作為首選的臨床檢測標本。最近有研究對104例確診為非中性粒細胞減少患者的全血與血清進行了PCR檢測分析，結果顯示血清的陽性率可達100%，而全血的陽性率只有70%，這表明血清比全血具有更高的敏感度［3－4］。

Morace等［5］分別用PCR和血培養(yǎng)方法檢測全血及血清中的念珠菌，結果顯示PCR技術具有更高的敏感性。Ahmad等［6］報道了通過半套式PCR檢測念珠菌rRNA基因操縱子的轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）可鑒別混合念珠菌感染，而這種雙重感染通過培養(yǎng)不易檢出，特別是當某一種菌株的增長速度顯著增高時檢測更加困難。Dunyach等［7］對兩種實時PCR檢測方法的靈敏度進行了評估，一種是針對5種念珠菌的ITS區(qū)域，另一種是將18SrRNA作為目的基因，均通過熔融曲線形態(tài)來進行分析。結果表明，ITS擴增長度的變異可導致分析靈敏度發(fā)生相應變化，后者具有更高的靈敏度。

Maaroufi等［8］分別用血培養(yǎng)和實時定量PCR方法對69例臨床確診或疑似系統(tǒng)性念珠菌感染患者的血液標本進行了檢測，結果顯示兩種方法的敏感性和特異性幾乎相當。該PCR檢測方法采用了兩種可變的水解探針，一種是只針對白色念珠菌的6－羧基熒光素（FAM）標記探針，另一種是針對五大主要念珠菌的四氯－6－羧基熒光素（TET）標記探針。兩種探針診斷的敏感性均為100%，特異性分別為97%和72%［9］。此外，這兩種探針與人類rRNA基因的部分序列具有相似性，與其他生物體如曲霉屬、酵母菌和鐮刀菌等均有顯著的交叉反應。由于念珠菌與許多其他常見的病原體相比，屬系發(fā)育更多樣化［10－12］，評估探針特異性以及引物和探針相互雜交的可能性是關鍵因素。此外，選擇合適的標本種類和提高核酸提取效率也非常重要［13－15］。

3 PCR技術診斷真菌感染的廣譜篩查

混合真菌感染（尤其在抗真菌治療）時，由于主菌的過度生長，其他菌可能不易被檢測到。念珠菌屬的系統(tǒng)發(fā)育具有多樣性，對不同抗真菌藥物敏感性也有所不同。多重PCR在檢測真菌混合感染中可發(fā)揮重要作用。并非所有的病原真菌可以通過培養(yǎng)迅速繁殖，故陰性測試結果不能排除真菌感染的可能性［16］。廣譜PCR檢測的引物是針對該分類單元中所有生物體的高度保守基因序列。例如，廣譜細菌PCR檢測引物的特異性是針對細菌高度保守基因16SrRNA或RNA聚合酶基因序列［17］。這些基因幾乎存在于所有細菌，且都包含與廣譜引物作用理想的保守區(qū)和有利于確定物種的可變區(qū)序列。從理論上講，廣譜真菌PCR檢測可以實現(xiàn)大多數(shù)真菌病原體的檢測，將其與其他方法如熔融曲線分析相結合，可快速進行物種鑒定［18］。

PCR擴增可以針對真菌rRNA基因操縱子的ITS1區(qū)，并進行測序，以確認物種的身份。為鑒別臨床相關真菌病原體，除ITS的rRNA操縱子以外，18SrRNA基因與28SrRNA基因的高變序列D1－D2區(qū)也常作為PCR檢測的靶基因［19］。最近有研究表明，28SrRNA基因中D1－D2區(qū)以外的序列也可用于廣譜真菌PCR的檢測［20］。雖然大多數(shù)廣譜真菌PCR的研究都集中在有曲霉菌和念珠菌屬感染的患者，而Khot等［21］成功鑒別了多種真菌，包括念珠菌、隱球菌、孢霉菌、曲霉菌、鐮刀菌、絲孢菌屬、外小杯菌、明臍菌屬、鱗質霉屬、放射毛霉屬和根霉菌屬。如果以培養(yǎng)和組織病理學方法作為金標準，其結果準確率分別為93.6%和64.3%。

與特定病原體屬種的PCR檢測相比，廣譜PCR檢測IFD的診斷特異性可能由于假陽性率（false－positive，F(xiàn)P）較高而有所下降［22－24］。除了污染，F(xiàn)P較高可能由定植于采樣點的共生真菌引起，也可能由缺乏準確的IFD臨床分類標準造成。提高廣譜真菌PCR產(chǎn)物的物種鑒定水平是促進解析假陽性結果的關鍵因素。

PCR技術是診斷IFD的主要方向，但是如何繼續(xù)發(fā)展，目前有兩種觀點。第一種觀點認為，已經(jīng)開發(fā)了通過PCR診斷真菌感染所需的大部分專有技術，現(xiàn)在是進行大規(guī)模臨床檢測驗證時期。第二種觀點則認為，需要做更多的研究，以對臨床樣本進行優(yōu)化選擇、進一步改善樣本的收集和處理以及DNA提取方法、加強PCR檢測技術的質量控制等，以最大限度地提升診斷特異性，有效提高診斷效率。高分辨率的熔融溫度分析已廣泛用于種屬特定PCR或廣譜真菌PCR檢測，微球雜交技術如液相芯片技術等將更廣泛地用于PCR產(chǎn)物的物種水平鑒定和質譜分析［25］。無論是單重PCR反應還是多重PCR，將重點探討發(fā)展可用于診斷混合感染的分析方法，實時定量模式將成為真菌靶向檢測的規(guī)范。

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