孫曉彩，李文斌，趙 麗，賈會賢，王 芳，張 敏，李淑琴

（1．河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，2．河北省醫(yī)學(xué)生物技術(shù)實驗室，石家莊050017；3．河北省公安廳，石家莊050000）

我室研究證實，反復(fù)3次股動脈夾閉和開放的肢體缺血預(yù)處理（limb ischemic preconditioning，LIP）可減輕隨后即刻發(fā)生的全腦缺血／再灌注引起的大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的延遲性死亡和凋亡、誘導(dǎo)腦缺血耐受，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用［1-3］。此外，分別應(yīng)用p38 MAPK及HSP 70特異性抑制劑能部分阻斷LIP的腦保護(hù)作用，證實了LIP通過上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK和HSP 70的表達(dá)誘導(dǎo)了腦缺血耐受，并證實了LIP通過p38 MAPK上調(diào)了HSP70的表達(dá)［4］。在我們的實驗中，8 min全腦缺血打擊使得大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元幾乎全部死亡，而CA3區(qū)和齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)的神經(jīng)元則相對耐受、無神經(jīng)元的明顯死亡，這一結(jié)果與既往研究者的結(jié)論是相同的［5，6］。正是由于CA3區(qū)和DG區(qū)對缺血性損傷相對耐受，很少有研究者注意到預(yù)處理對這兩個區(qū)域細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)表達(dá)的影響。如果大腦面臨較長時間的缺血打擊，也必將使CA3區(qū)及DG區(qū)的神經(jīng)元發(fā)生死亡，LIP能否通過上調(diào)p38 MAPK和HSP 70的表達(dá)在上述區(qū)域也發(fā)揮腦保護(hù)作用，尚未見文獻(xiàn)報道。因此，本研究旨在探討LIP對大鼠海馬CA3區(qū)及DG區(qū)p38 MAPK和HSP 70表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討CA3區(qū)和DG區(qū)的缺血耐受機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠（250～300）g 96只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機(jī)分為8組（n＝12，6只用于免疫組織化學(xué)，6只用于 Western blot）：（1）sham組：只暴露雙側(cè)股動脈50 min，但不夾閉；（2）LIP組：夾閉雙側(cè)股動脈 10 min、再灌流 10 min、反復(fù)3次，根據(jù)LIP后再灌注的時間進(jìn)一步分為LIP 6 h、LIP 12 h、LIP 1 d、LIP 2 d、LIP 3 d、LIP 4 d和 LIP 5 d亞組，于LIP后相應(yīng)時間點取材。

1．2 肢體缺血預(yù)處理

乙醚麻醉大鼠，仰臥位固定，在雙側(cè)后肢股三角處剪毛，沿血管走行切開皮膚、皮下組織，鈍性分離縫匠肌后部，游離股動脈，用無損傷小血管夾夾閉股動脈10 min，松開血管夾再灌流10 min，反復(fù)3次。手術(shù)過程中，創(chuàng)口局部施予局麻藥（1%普魯卡因）防止疼痛。LIP后縫合創(chuàng)口，局部應(yīng)用慶大霉素預(yù)防感染。

1．3 免疫組織化學(xué)

于預(yù)定的時間點將動物深麻（10%水合氯醛，350 mg／kg），生理鹽水（0℃ ～4℃，約 150 ml）、4%多聚甲醛（0℃～4℃，約200 ml）灌注固定。冠狀切取視交叉后3 mm腦片，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。石蠟包埋，常規(guī)制作石蠟切片，片厚5～6μm。二甲苯、梯度酒精（100%～70%）脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶。微波修復(fù)抗原，血清封閉，滴加p-p38 MAPK一抗（兔抗鼠多克隆抗體，Cell Signaling，Cat no．：4631S，lot no．：4）或HSP 70一抗（兔抗鼠多克隆抗體，Neomarkers，Cat no．：RB-080-A0，lot no．：080A604B），濃度均為 1∶120，4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG，Santa Cruz，Cat no．：SP-9001，lot no．：50581654），37℃孵育50 min，DAB顯色，脫水透明，封片。在光鏡下觀察海馬CA3區(qū)及DG區(qū)陽性細(xì)胞的形態(tài)及分布特征。通過彩色圖文分析系統(tǒng)，計數(shù)視野內(nèi)陽性細(xì)胞平均光密度及總面積，以反映免疫組織化學(xué)染色的程度。每個標(biāo)本測量5個視野，取其平均值。

1．4 海馬CA3區(qū)和DG區(qū)Western blot檢測

以上各組動物在預(yù)定時間點迅速斷頭取腦，在0℃～4℃生理鹽水中分離出雙側(cè)海馬CA3區(qū)和DG區(qū)，分析天平稱重后加入5倍體積的預(yù)冷裂解液制成勻漿。裂解液含有 20 mmol／L Tris-HCl（pH 7．5）、1 mmol／L EDTA、5 mmol／L MgCl2、1 mmol／L DTT、10 g／ml pepstatin A、2 mmol／L sodium orthovanadate、50 mmol／L NaCl和 1 mmol／L PMSF。 取 上 清 分 裝，－80℃保存待測。采用改良酚試劑法測定海馬CA3區(qū)和DG區(qū)組織蛋白的含量。取蛋白樣品加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液后于95℃～100℃煮5 min，將樣品分別加入10%SDS-PAGE凝膠加樣孔中，恒壓電泳（濃縮膠 80 V，分離膠 100 V），預(yù)染marker指示下切膠，恒壓（60 V，2 h）條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TTBS洗膜3次，每次5 min。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。加入p-p38 MAPK或HSP 70一抗（同免疫組化）或β-actin（Rabbit Aβ-actin，Boaosen，Cat no．：BS-0061R，lot no．：061204），4℃孵育過夜。次日取膜復(fù)溫后，TTBS洗膜 3次，每次 5 min，加入二抗（羊抗兔 IgG，KPL，Cat no．：16-15-06，lot no．：030785），37℃孵育 1 h。TTBS洗膜 3次，每次 5 min，DAB顯色。應(yīng)用 Gel-Pro Analyzer Version 3．0凝膠成像分析系統(tǒng)分析所得條帶的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，用目的蛋白條帶與βactin條帶的IOD值的比值作為統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，單因素方差分析（one way ANOVA）進(jìn)行組間比較，有顯著差異者用最小顯著差法（least significant difference，LSD）進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：p-p38 MAPK及HSP 70陽性表達(dá)產(chǎn)物均為棕黃色顆粒，分布于細(xì)胞的胞漿和胞核。sham組大鼠海馬CA3區(qū)及DG區(qū)細(xì)胞中pp38 MAPK及HSP 70的表達(dá)較少（圖1，2）。LIP后，海馬CA3區(qū)及DG區(qū)p-p38 MAPK及HSP 70的表達(dá)呈現(xiàn)出動態(tài)的變化：其中p-p38 MAPK于LIP后1 d表達(dá)明顯增多（圖1A），所測陽性細(xì)胞的光密度和總面積與sham組相比均有顯著性差異（P＜0．05）（圖1B），LIP后3 d達(dá)到高峰，4 d后逐漸回落（圖1A和B）；HSP 70的表達(dá)于LIP后2 d明顯增多，3 d達(dá)到高峰，4 d后逐漸減少（圖2A和B）。

Fig．1 Immunohistochemistry shows the time course of p-p38 MAPK expression in the rat CA3 and DGhippocampal fields after limb ischemic preconditioning（LIP）A：Immunohistochemical staining photomicrographs fromeach group（DABstaining，Scale bar：20μm）；B：Immunostaining with optical density and total area of the immuno-positive cells*P＜0．05 vs sham group

Fig．2 Immunohistochemistry shows the time course of HSP 70 expression in the rat CA3 and DGhippocampal fields after limb ischemic preconditioning（LIP）A：Immunohistochemical staining photomicrographs fromeach group（DABstaining，Scale bar：20μm）；B：Immunostaining with optical density and total area of the immuno-positive cells*P＜0．05 vs sham group

Western blot結(jié)果顯示：與sham組相比，LIP后大鼠海馬CA3區(qū)及DG區(qū)p-p38 MAPK及HSP 70的表達(dá)均增加，且二者的變化趨勢與免疫組化的結(jié)果一致：p-p38 MAPK于LIP后1 d開始增多、LIP后3 d達(dá)到高峰；HSP70于LIP后2 d開始增多、LIP后3 d達(dá)到高峰（圖3A和B）。

Fig．3 Western blot analysis shows the time course of p-p38 MAPK and HSP 70 expression in the rat CA3 and DG hippocampal fields after limb ischemic preconditioning（LIP）A：Immunoblot bands in the following groups：sham，6 h，12 h，1 d，2 d，3 d，4 d and 5 d of reperfusion following LIP．Five independent experiments yielded similar results；B：Immunoblots with integral optical density（IOD）．The ratio of the IOD of immunoblot of the protein of interest toβ-actin was used for statistical analysis*P＜0．05 vs sham group

3 討論

雖然腦缺血的發(fā)生無法預(yù)測，但是在心臟及大血管圍手術(shù)期或是心肺分流術(shù)等一些發(fā)生腦缺血危險幾率較高的手術(shù)中，全腦缺血性損傷是可以預(yù)知的。如果能在損傷發(fā)生之前就施予干預(yù)措施、避免或是減輕缺血打擊對大腦造成的損傷，無疑具有重要的現(xiàn)實意義。我室既往研究證實，肢體缺血預(yù)處理能誘導(dǎo)大鼠的腦缺血耐受，使海馬CA1區(qū)在遭受缺血性打擊后免受損傷，并且LIP的腦保護(hù)作用與NO［1］、p38 MAPK［2，3］、HSP 70［4］、c-fos［7］、ERK［8］、SOD［9］等的上調(diào)有關(guān)。

缺血時間的長短決定了海馬各區(qū)神經(jīng)元受損的程度。在我們的試驗中，8 min全腦缺血／再灌注造成大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生延遲性死亡，而對CA3區(qū)及DG區(qū)的神經(jīng)元無明顯影響。我們已經(jīng)證實，在大鼠海馬CA1區(qū)，LIP通過上調(diào)p38 MAPK和HSP 70的表達(dá)發(fā)揮了部分腦保護(hù)作用［4］。但是，如果大腦面臨更長時間的缺血打擊，也必將使CA3區(qū)及DG區(qū)的神經(jīng)元發(fā)生死亡，LIP能否能通過上調(diào)p38 MAPK和HSP 70的表達(dá)在上述區(qū)域也發(fā)揮腦保護(hù)作用尚未見報道。

我們在本實驗中觀察到，LIP能夠明顯上調(diào)大鼠海馬CA3區(qū)及DG區(qū)p38 MAPK和HSP 70的表達(dá)，并且p-p38 MAPK上調(diào)的起始時間明顯早于HSP 70表達(dá)上調(diào)的起始時間。既然LIP能通過上調(diào)p38 MAPK和HSP 70的表達(dá)誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)的缺血耐受［4］，提示 LIP上調(diào)的 p38 MAPK和 HSP 70也可能參與了CA3區(qū)和DG區(qū)的腦保護(hù)作用。如果摸索一個足以引起CA3區(qū)和DG區(qū)細(xì)胞死亡的缺血打擊時間，并觀察LIP及p38 MAPK和HSP 70在其中的作用，將為以上設(shè)想提供更為充實的實驗證據(jù)。我們將在下一步的實驗中解決上述問題。

海馬分為CA1～CA4區(qū)，在大鼠不存在CA2區(qū)，CA4區(qū)有時指齒狀回的多形層，有時指伸入齒狀回的錐體細(xì)胞區(qū)，為避免混淆已基本不用。因而，大鼠的海馬通常由CA1和CA3兩個區(qū)組成，形狀如大C字形，DG區(qū)像一反寫的小C，與大C連接，構(gòu)成S形狀。CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)在腦組織內(nèi)緊密相鄰，因而在LIP后可能啟動了相同的分子機(jī)制，即LIP通過上調(diào)了海馬p38 MAPK和 HSP 70的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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