王 浩，葉 平，李 泱，李宗斌，王 琳

（1．解放軍總醫(yī)院南樓心血管二科，2．解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所，北京100853）

缺血／再灌注損傷是指組織缺血后恢復(fù)血供而引起的更為嚴(yán)重的組織損傷。在再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致細(xì)胞再灌注損傷的重要因素，因此再灌注過(guò)程中，針對(duì)抗凋亡機(jī)制的細(xì)胞保護(hù)可能提供減輕再灌注損傷的新方法。既往我們研究發(fā)現(xiàn)臨床用于治療2型糖尿病的噻唑烷二酮類藥物具有抗心肌缺血／再灌注損傷的作用，主要機(jī)制是減輕再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡［1-3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)分子，對(duì)缺血／再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用［4］，但吡格列酮對(duì)TGFβ1在缺血／再灌注時(shí)的影響報(bào)道較少。本研究在原有研究基礎(chǔ)上，觀察作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）激活劑的吡格列酮對(duì)缺血／再灌注損傷大鼠心肌組織 TGFβ1表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討吡格列酮抗缺血／再灌注損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要藥品和試劑

吡格列酮由北京太陽(yáng)藥業(yè)提供；TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL2000購(gòu)自晶美公司；兔抗大鼠TGFβ1抗體及山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；PPARγ特異性阻斷劑GW9662購(gòu)自Sigma公司；引物合成，北京諾賽基因組研究中心有限公司。

1．2 動(dòng)物及分組

健康雄性 SD大鼠30只，體重200～350 g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組（n＝6）：（1）缺血／再灌注組；（2）吡格列酮 5 mg／（kg·d）組；建立缺血／再灌注模型前吡格列酮灌胃，5 mg／（kg·d）×7 d；（3）吡格列酮 10 mg／（kg·d）組：建立模型前吡格列酮灌胃，10 mg／（kg·d）×7 d；（4）吡格列酮20 mg／（kg·d）組：建立模型前吡格列酮灌胃，20 mg／（kg·d）×7 d；（5）吡格列酮 20 mg／（kg·d）＋GW9662組：吡格列酮灌胃，20 mg／（kg·d）×7 d，建立模型前靜脈注射 GW9662 0．3 mg／kg。

1．3 模型建立

以10%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠（0．1 ml／kg），監(jiān)測(cè)心電圖。氣管切開(kāi)插管，通氣頻率70 b／min，吸呼比1．25∶1。開(kāi)胸，以帶6／0線的眼科針在冠狀動(dòng)脈根部下1～2 mm、肺動(dòng)脈竇和左心耳之間穿過(guò)，中間墊一塑料管，止血鉗夾緊，觀察心電圖及左室前壁心肌顏色變化。心電圖ST段抬高，同時(shí)心肌組織顏色變暗判斷為結(jié)扎成功。30 min后拔出塑料管，使冠狀動(dòng)脈血流再通120 min，再灌注時(shí)局部組織充血。再灌注結(jié)束后迅速剪下心臟，在心室前壁相同位置留取心肌組織液氮冷凍，分別準(zhǔn)備檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡、提取蛋白及組織RNA。

1．4 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

（1）方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，新配制的3%H2O2溶液室溫放置 10 min，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 （peroxisomase，POD）；蛋白酶 K（25μg／ml）37℃消化 30 min；加 TUNEL混合液，濕盒 37℃，60 min，加 ulcon-POD，37℃，30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。標(biāo)記前用DNA酶處理切片做陽(yáng)性對(duì)照，用標(biāo)記液代替TUNEL反應(yīng)液做陰性對(duì)照。（2）檢測(cè)內(nèi)容：陽(yáng)性細(xì)胞核和（或）細(xì)胞碎片呈深淺不一的棕黃色，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400），記數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，以凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）反映各組心肌凋亡的情況，AI＝（視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)／視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)）×100%。

1．5 定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定TGFβ1 mRNA表達(dá)

應(yīng)用TRIzol提取組織總RNA，應(yīng)用紫外線分光光度儀測(cè)定 RNA濃度，取4μg RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。TGFβ1引物序列：上游引物：GGACTACTACGCCAAAGAAG，下游引物：TCAAAAGACAGCCACTCAGG，產(chǎn)物為294 bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，退火溫度64℃，退火時(shí)間45 s，72℃延伸45 s，26個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)采用Gene Amp PCR system 2400（美國(guó)）。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將凝膠結(jié)果進(jìn)行掃描，以平均光密度比值進(jìn)行相對(duì)定量。

1．6 免疫雜交 （Western blot）測(cè)定 TGFβ1蛋白表達(dá)變化

組織勻漿，BCA法蛋白定量，蛋白制樣，配制SDS-PAGE凝膠，上樣量 40μg／lane，采用 BIO-RAD電泳系統(tǒng)（美國(guó)）80 V 45 min濃縮，120 V 80 min進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜、封閉、加TGFβ1一抗，稀釋濃度1∶1 000，加二抗雜交、化學(xué)發(fā)光顯色，以相對(duì)比值進(jìn)行相對(duì)定量，即各蛋白目的條帶光密度相對(duì)強(qiáng)度＝各蛋白目的條帶灰度值／假手術(shù)組蛋白目的條帶灰度值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用奇思統(tǒng)計(jì)軟件（2004版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間數(shù)據(jù)比較采用ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 吡格列酮對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL檢測(cè)結(jié)果，缺血／再灌注組心肌細(xì)胞A I為40．1% ±12．3%，吡格列酮 5、10、20 mg／（kg·d）組分別為 21．4% ±8．8%、17．3%±8．7%、14% ±9．6%，與缺血／再灌注組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。吡格列酮 20 mg／（kg·d）＋GW9662組AI為35%±11．3%，與各吡格列酮組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖 1）。

Fig．1 Effects of pioglitazone on myocardial apoptosis in the ischemia／reperfusion model of rat hearts 1：Ischemia／reperfusion group；2：PIO 5 mg／（kg·d）group；3：PIO 10 mg／（kg·d）group；4：PIO 20 mg／（kg·d）group；5：PIO 20 mg／（kg·d）＋GW9662 group；PIO：Pioglitazone*P＜0．05 vs 1 group；＃P＜0．05 vs 2 group；△P＜0．05 vs 3 group；▲P＜0．05 vs 4 group

2．2 吡格列酮對(duì)TGFβ1 mRNA表達(dá)的影響

與缺血／再灌注組比較，吡格列酮 5、10、20 mg／（kg·d）組 TGFβ1 mRNA在缺血／再灌注后表達(dá)上調(diào)（P＜0．05），吡格列酮各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。與吡格列酮各組比較，吡格列酮 20 mg／（kg·d）＋GW9662組 TGFβ1 mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0．05，圖 2）。

Fig．2 Effects of pioglitazone on TGFβ1 mRNA expression A：TGFβ1 mRNA expression；B：Densitometric analysis of TGFβ1 mRNA signals；1：Ischemia／reperfusion group；2：PIO 5 mg／（kg·d）group；3：PIO 10 mg／（kg·d）；4：PIO 20 mg／（kg·d）；5：PIO 20 mg／（kg·d）＋GW9662 group；PIO：Pioglitazone；TGFβ1：Transforming growth factorβ1*P＜0．05 vs 1 group；＃P＜0．05 vs 2 group；△P＜0．05 vs 3 group；▲P＜0．05 vs 4 group

2．3 吡格列酮對(duì)TGFβ1蛋白表達(dá)的影響。

與缺血-再灌注組比較，吡格列酮 5、10、20 mg／（kg·d）組TGFβ1蛋白在缺血／再灌注后表達(dá)上調(diào)（P＜0．05），吡格列酮各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。與吡格列酮各組比較，吡格列酮 20 mg／（kg·d）＋GW9662組 TGFβ1蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0．05，圖3）。

3 討論

心肌缺血后實(shí)行再灌注過(guò)程在挽救存活細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)帶來(lái)細(xì)胞的損傷。再灌注損傷成為阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題。再灌注損傷與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基及炎癥介質(zhì)有關(guān)，如何防治缺血／再灌注損傷已成為目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題［5］。近年針對(duì)缺血／再灌注損傷保護(hù)的研究涉及缺血預(yù)適應(yīng)、藥物預(yù)適應(yīng)等，可用于預(yù)適應(yīng)的藥物包括阿片受體拮抗劑等［5］。鈣離子拮抗劑Adalat可抑制缺血／再灌注后心肌細(xì)胞凋亡，縮小梗死面積［6］。同時(shí)缺血／再灌注所涉及的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制復(fù)雜，包括細(xì)胞外信號(hào)分子、細(xì)胞膜上信號(hào)接收器、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其效應(yīng)器等多方面的變化，并在多層次和諸多環(huán)節(jié)存在交互作用。深入認(rèn)識(shí)再灌注損傷的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有助于闡明其細(xì)胞分子機(jī)制，為臨床防治提供新的思路［7］。

Fig．3 Effects of pioglitazone on TGFβ1 protein expression A：Immunoblot of TGFβ1 expression；B：Densitometric analysis of TGFβ1 protein signals；1：Ischemia／reperfusion group；2：PIO 5mg／（kg·d）group；3：PIO 10mg／（kg·d）group；4：PIO 20mg／（kg·d）group；5：PIO 20mg／（kg·d）group＋GW9662 group；PIO：Pioglitazone；TGFβ1：Transforming growth factorβ1*P＜0．05 vs 1 group；＃P＜0．05 vs 2 group；△P＜0．05 vs 3 group；▲P＜0．05 vs 4 group

臨床用于治療2型糖尿病的噻唑烷二酮類藥物是PPARγ激活劑，本實(shí)驗(yàn)室既往研究證實(shí)，吡格列酮可以通過(guò)劑量依賴性方式抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，縮小缺血／再灌注后梗死面積，保護(hù)心肌。本研究發(fā)現(xiàn)，與缺血／再灌注組比較，三種劑量吡格列酮組的TGFβ1表達(dá)明顯增加，提示吡格列酮可能通過(guò)上調(diào)TGFβ1表達(dá)發(fā)揮抗凋亡的保護(hù)作用。TGFβ1參與許多重要的發(fā)育決定，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、細(xì)胞黏附等。與心肌缺血／再灌注損傷關(guān)系密切。研究提示TGFβ1有助于減輕心肌缺血／再灌注損傷，保護(hù)心?。?］。借助病毒載體將TGFβ1導(dǎo)入體內(nèi)進(jìn)行基因治療是一條希望之路［4］。Dandapat A等人利用將TGFβ1注射入大鼠心臟，在證實(shí)TGFβ1在整個(gè)心臟過(guò)表達(dá)之后予以缺血／再灌注，與對(duì)照組相比，TGFβ1注射組的心肌梗死面積明顯縮小，這種作用與NADPH氧化酶和NF-kappaB的激活減少及心肌組織丙二醛水平降低相關(guān)，提示TGFβ1過(guò)表達(dá)對(duì)心肌的保護(hù)作用是通過(guò)抗氧化實(shí)現(xiàn)的［9］。Chen H等發(fā)現(xiàn)將大鼠應(yīng)用重組TGFβ1預(yù)處理，再予以缺血／再灌注時(shí)可以明顯減輕心肌壞死和心臟功能異常，并下調(diào)缺血／再灌注誘發(fā)的高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1），提示保護(hù)作用與下調(diào) MMP-1有關(guān)［10］。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，PPARγ特異性阻斷劑GW9662逆轉(zhuǎn)了吡格列酮對(duì)凋亡細(xì)胞的抑制作用，抑制吡格列酮促進(jìn)TGFβ1表達(dá)上調(diào)的作用，提示吡格列酮對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及上調(diào)TGFβ1表達(dá)的作用上調(diào)可能是由PPARγ介導(dǎo)的。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡格列酮抑制缺血／再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，能在mRNA及蛋白水平上調(diào)TGFβ1，提示 TGFβ1信號(hào)通路可能是吡格列酮發(fā)揮保護(hù)作用的信號(hào)途徑之一，這種作用可能是由PPARγ介導(dǎo)的。但是，在缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用中，TGFβ1的下游靶分子或靶細(xì)胞器尚需要進(jìn)一步的研究來(lái)明確其具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

［1］ Cao Z L，Ye P，Long C L，et al．Effect of pioglitazone，a peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist，on ischemia-reperfusion injury in rats［J］．Pharmacol，2007，79（3）：184-192．

［2］ 曹澤玲，葉 平，龍超良，等．吡格列酮對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中華心血管病雜志，2005，31（7）：648-652．

［3］ 曹澤玲，葉 平，龍超良，等．吡格列酮對(duì)大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)研究［J］．中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005，10（10）：1112-1117．

［4］ Hermonat PL，Li D，Yang B，et al．Mechanism of action and delivery possibilities for TGFbeta1 in the treatment of myocardial ischemia［J］．Cardiovasc Res，2007，74（2）：235-243．

［5］ 昝香怡，李培杰，張正義，等．阿片受體拮抗劑對(duì)大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)［J］．中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2007，19（11）：693-694．

［6］ 馮全洲，李天德，王兆霞，等．鈣離子拮抗劑對(duì)大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］．中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2004，16（3）：133-136．

［7］ 韓 笑，劉建勛．心肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2004，20（1）：4-7．

［8］ Flanders K C，Burmester JK．Medical applications of transforming growth factor-beta［J］．Clin Med Res，2003，1（1）：13-20．

［9］ Dandapat A，Hu CP，Li D，et al．Overexpression of TGF-beta1 by adeno-associated virus type-2 vector protects myocardium from ischemia-reperfusion injury［J］．Gene Ther，2008，15（6）：415-423．

［10］ Chen H，Li D，Saldeen T，et al．TGF-beta 1 attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury via inhibition of upregulation of MMP-1［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284（5）：H1612-1617．