趙 磊，尚媛媛，司軍強(qiáng)，李新芝，李 麗，張忠雙，馬克濤Δ

（1．石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．生理學(xué)教研室，3．病理生理學(xué)教研室，新疆石河子832002）

以腦卒中為主的腦血管病是影響人類健康的主要疾病，高血壓是被公認(rèn)的腦卒中最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。眾所周知，血管緊張度增加是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵，而微動(dòng)脈和小動(dòng)脈的肌源性張力是血管外周阻力及血壓形成的重要因素［1］。高血壓所致的顱內(nèi)大、小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)和功能的改變是腦卒中發(fā)生的基礎(chǔ)，在這一過程中，血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）內(nèi)的離子有著非常重要的作用。VSMCs膜上的離子通道對(duì)離子的異常轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，包括腦動(dòng)脈（brain artery，BA）在內(nèi)的VSMCs上有Ca2＋通道、K＋通道、Cl-通道和非選擇性陽離子通道等多種離子通道的表達(dá)［2］。高血壓發(fā)展過程中，這些離子通道有可能發(fā)生變化，從而引起細(xì)胞內(nèi)離子濃度的異常，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。本研究通過比較研究自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）和正常 Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電流的異同，進(jìn)一步闡述高血壓形成機(jī)制。

1 材料及方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用36周齡SHR大鼠及正常血壓Wistar大鼠，雌雄不拘，體重在（200～250）g，分別購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司（許可證編號(hào)SCXK京2007-0001）和新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。用BP-6無創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀測(cè)量大鼠清醒安靜狀態(tài)下尾動(dòng)脈的血壓。

1．2 標(biāo)本制備

大鼠在麻醉狀況下放血處死，迅速取出腦，置于生理鹽溶液中，溶液成分如下（mmol／L）：NaCl 138，KCl 5，CaCl21．6，MgCl21．2，Na-HEPES5，HEPES6，葡萄糖 7．5。在生理鹽溶液中，迅速取出 BA及其分支。

單個(gè)平滑肌細(xì)胞制備：將微動(dòng)脈放置低Ca2＋緩沖液中 20 min，低 Ca2＋緩沖液成分為（mmol／L）：NaCl 142、KCl 5、CaCl20．05、MgCl21、Na-HEPES 4、HEPES 5、葡萄糖7．5。在體顯微鏡下將微動(dòng)脈剪成幾段放入消化液中，在37℃溫箱中消化20～25 min，消化液成分包括（mg／ml）：木瓜蛋白酶 0．75、膠原酶 IA 1、牛血清白蛋白 3．75、二硫蘇糖醇 0．3。離心（1 000 r／min，6 min）后棄上清液用低 Ca2＋溶液替代，如此反復(fù)替換三次后，將液體移至用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿上靜置30 min使細(xì)胞貼壁。

1．3 全細(xì)胞膜片鉗記錄

在室溫條件下（22℃～25℃）使用Axon 700B放大器（Axon公司，美國）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極尖端直徑約為1μm，電極阻抗約為5 MΩ，由P-97拉制儀（Sutter公司，美國）拉制。電極內(nèi)液成分是（mmol／L）：K-gluconate 130，NaCl 10，CaCl22．0，Mg-Cl21．2，HEPES 10，EGTA 5，葡萄糖 7．5。通過微操縱器接觸到細(xì)胞后給予負(fù)壓形成GΩ封接。補(bǔ)償電極電容后給予瞬時(shí)較強(qiáng)負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗。膜電流用10 kHz低頻濾過。生物電信號(hào)通過 PC計(jì)算機(jī)記錄（Axoscope10．2軟件，Axon公司，美國）。采樣間隔為 10、20或 100 μs［3，4］。

1．4 主要試劑

所用藥物用生理鹽溶液配制，加藥通過切換開關(guān)控制，能保持灌流速度、溫度和其它成分不變。所用藥物有：4-aminopyridine（4-AP）、tetraethylammonium（TEA）由Sigma公司提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS16．0分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（ˉx±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 SHR和Wistar大鼠尾動(dòng)脈血壓的比較

SHR大鼠的收縮壓為（189．3±6．7）mmHg，明顯高于正常 Wistar大鼠的收縮壓（117．6±5．4）mmHg（P＜0．01）。

2．2 SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞電流密度的異同

圖1所示為應(yīng)用階躍電壓激活的SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞膜電流的異同。當(dāng)指令電壓為＋60 mV時(shí)，Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞電流幅度為（530±66）pA（n＝35），電流密度為（44．3±6．0）pA／pF；SHR平滑肌細(xì)胞電流幅度為（1825±299）pA（n＝35），電流密度為 （148．1±25．8）pA／pF。當(dāng)指令電壓為0、＋20、＋40和＋60 mV時(shí)，SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的電流密度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。

Fig．1 Comparison of the current density of VSMCs in BA between SHR and Wistar rats VSMCs：Vascular smooth muscle cells；BA：Brain artery；SHR：Spontaneously hypertensive rats*P＜0．01 vs Wistar

SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞膜電流都呈明顯的外向整流特性。電壓依賴的K＋通道（voltage-gated K＋channel，Kv）阻斷劑 4-AP（1 mmol／L）和大電導(dǎo)鈣激活K＋通道（big conductance Ca2＋-activated K＋channel，BKCa）阻斷劑 TEA（1 mmol／L）對(duì)微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流敏感（圖2），提示SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的外向電流部分主要是通過激活Kv通道和BKCa通道介導(dǎo)。

2．3 SHR和Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞STOCs的異同

34%（18／53）SHR和 22%（10／45）Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上都記錄到了自發(fā)性瞬時(shí)外向K＋電流（spontaneous transient outward currents，STOCs），與Wistar大鼠相比，SHR的STOCs發(fā)放頻率和電流幅度都遠(yuǎn)大于 Wistar大鼠（圖3）。Wistar大鼠 STOCs的幅度及頻率（＋40 mV）分別為（217±24）pA和（0．54±0．05）Hz，SHR STOCs的幅度及頻率分別為（423±57）pA和（0．83±0．07）Hz（n＝16），分別增加了（57．2±14．3）% 和（64．3±16．8）%。

Fig．2 Outward current of VSMCs in BA of SHR and Wistar rats are composed by Kv and BKCaA-B：1 mmol／L TEA and 1 mmol／L 4-APpartly inhibited the outward current respectively；Kv：Voltage-gated K＋ channel；BKCa：Big conductance Ca2＋-activated K＋ channel

Fig．3 Comparison of the STOCs of VSMCs in BA between SHR and Wistar rats A：Representative STOCs of VSMCs in BA of SHRand Wistar rats；B：Column graph presentation of the frequency and amplitude of STOCs in BA of SHR and Wistar rats；STOCs：Spontaneous transient outward K＋ currents；SHR：Spontaneously hypertensive rats；BA：Brain artery*P＜0．05 vs Wistar

為了進(jìn)一步驗(yàn)證STOCs的性質(zhì)，觀察了1 mmol／L BKCa通道阻斷劑TEA和1 mmol／L Kv通道阻斷劑4-AP對(duì)STOCs的影響，TEA基本完全阻斷STOCs，而4-AP對(duì)STOCs沒有影響（圖4），提示 SHR和 Wistar大鼠腦動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上記錄到得STOCs由BKCa通道介導(dǎo)。

3 討論

Fig．4 STOCs of VSMCs mediated by BKCa A and B：1 mmol／L TEA almostly inhibited the STOCs，but not by 4-AP；STOCs：Spontaneous transient outward K＋ current；VSMCs：Vascular smooth muscle cells；BKCa：Big conductance Ca2＋-activated K＋ channel；4-AP：4-aminopyridine

在血管平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)四種K＋通道，分別是內(nèi)向整流K＋通道、ATP敏感K＋通道、Kv和BKCa［5］。它們通過影響 VSMCs的膜電位調(diào)節(jié)血管的張力及直徑，同時(shí)受多種血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)在SHR和Wistar大鼠BA上平滑肌細(xì)胞的外向電流由Kv和BKCa組成，但兩種平滑肌細(xì)胞的電流密度存在差異，SHR平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流明顯高于正常大鼠。有研究發(fā)現(xiàn)在SHR的主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈及下肢動(dòng)脈都存在BKCa通道的活性增強(qiáng)，且構(gòu)成BKCa通道的β1亞基的mRNA和蛋白的表達(dá)都高于正常大鼠［6］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。SHR平滑肌細(xì)胞上BKCa通道活性增強(qiáng)可能是由于電壓依賴性Ca2＋通道開放導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋濃度升高所致［7］。

BKCa通道由膜去極化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子所激活，通過對(duì)膜去極化和血管收縮的負(fù)反饋調(diào)節(jié)維持血管張力。BKCa通道受多種血管活性物質(zhì)（NO、前列腺素、內(nèi)皮素和血管緊張素II等）的調(diào)節(jié)，通道活性及電流大小直接影響到血管的舒縮功能［8］。BKCa通道活性改變可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的興奮及代謝調(diào)節(jié)等多種生理過程，其功能異常牽涉到高血壓等疾病的發(fā)生［9］。高血壓時(shí)平滑肌細(xì)胞肌源性張力增高與其去極化狀態(tài)有關(guān)，作為阻力血管的腦動(dòng)脈，平滑肌細(xì)胞靜息膜電位改變與高血壓的發(fā)生更具有相關(guān)性。

此外，本實(shí)驗(yàn)在SHR和Wistar大鼠BA平滑肌細(xì)胞上成功記錄到STOCs，且SHR的STOCs發(fā)放頻率和電流幅度都遠(yuǎn)大于Wistar大鼠，兩種平滑肌細(xì)胞上的STOCs都是由BKCa通道介導(dǎo)。STOCs發(fā)生起源于BKCa通道激活，與胞膜上10～100個(gè)左右的BKCa通道的同步開放相一致，低頻率的STOCs（1 Hz）即可明顯影響膜電位，平滑肌舒張。越來越多的研究表明由BKCa通道介導(dǎo)的STOCs在血管平滑肌的肌源性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，Jaggar JH［10］等研究發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣庫的開放可產(chǎn)生鈣火花，引起細(xì)胞內(nèi)局部、瞬時(shí)的［Ca2＋］升高，進(jìn)而激活細(xì)胞膜上BKCa通道，產(chǎn)生 STOCs。STOCs可進(jìn)一步引起細(xì)胞膜超極化，抑制經(jīng)L型電壓依賴性Ca2＋通道的Ca2＋內(nèi)流，負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌收縮。

總的來說，本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)SHR和Wistar大鼠BA平滑肌細(xì)胞的電流密度存在差異，SHR平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流明顯增強(qiáng)，且更易誘發(fā)由 BKCa通道介導(dǎo)的 STOCs。BKCa通道和STOCs介導(dǎo)的K＋外流引起血管平滑肌細(xì)胞超極化，血管舒張，降低外周血管阻力，反饋性的抑制血管張力，可能是阻止血壓升高的保護(hù)機(jī)制。

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