張玉軍，陳硯凝，鄭書深，劉青娟，郝 軍，韓 嫣，楊保衛(wèi)，劉淑霞△

（1．河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，石家莊050017；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科，石家莊050012；3．石家莊人民醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，石家莊050091；4．河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊050017；5．解放軍總參三部保定干休所衛(wèi)生所，河北保定071000）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）重要的并發(fā)癥，也是患者死亡的重要原因之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者常伴有脂代謝的異常，低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低是其重要的特點(diǎn)，同時(shí)脂代謝異常的水平與患者的疾病活動(dòng)度有關(guān)［1-3］。另有研究顯示，脂代謝異常與患者的腎臟損害密切相關(guān)。

我們的前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，SLE患者伴有血脂水平的升高，且升高與LN的發(fā)生密切相關(guān)；同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在狼瘡性腎炎小鼠腎組織中系膜區(qū)油紅O染色陽(yáng)性，提示在狼瘡性腎炎腎組織中有脂滴沉積，同時(shí)伴有小鼠血脂升高，推斷在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中伴有脂代謝的異常，但脂質(zhì)沉積的機(jī)制如何，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

高遷移率族蛋白1（high mobility group protein 1，HMGB1）作為一種晚期炎癥介質(zhì)參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，且于狼瘡性腎炎患者及小鼠血清和腎組織中均表達(dá)上調(diào)［4］，但其表達(dá)與腎小球系膜細(xì)胞的脂質(zhì)沉積是否有關(guān)及可能機(jī)制，目前尚不清楚。

因此，本研究以小鼠系膜細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察γ-干擾素是否引起其脂質(zhì)沉積，并通過觀察HMGB1、SREBP-1及脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）的表達(dá)變化，探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

油紅O、IFN-γ和重組HMGB1購(gòu)自Sigma公司。Trizol和 Lipofectamine 2000購(gòu)自 Invitrogen公司。兔抗固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）、鼠抗 FAS單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗HMGB1抗體購(gòu)自Abcam公司，小鼠抗β-actin抗體和辣根酶標(biāo)記羊抗兔或羊抗小鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司。電化學(xué)發(fā)光（electrochemilu-minescence，ECL）試劑購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1．2．1 細(xì)胞 小鼠系膜細(xì)胞（MMC：ATCC No．CRL-1927）為本實(shí)驗(yàn)室凍存，以含5%胎牛血清的DMEM／F12（DMEM∶F12＝3∶1）培養(yǎng)基，于 37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1．2．2 細(xì)胞分組 （1）為了檢測(cè) IFN-γ對(duì) MMC中HMGB1、SREBP-1、FAS表達(dá)的影響，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細(xì)胞無血清培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分成2組：對(duì)照組（N）和 IFN-γ（500 IU／ml）刺激組（IFN-γ組），分別于0，2，4、6、8，12 h收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞；（2）為了進(jìn)一步確定HMGB1在IFN-γ誘導(dǎo)的MMC細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的作用，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細(xì)胞隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組（control）；IFN-γ（500 IU／ml）刺激組（IFN-γ組）；IFN-γ＋sh-HMGB1組和 IFN-γ＋空質(zhì)粒組，于IFN-γ刺激8 h時(shí)收集細(xì)胞；（3）為了確定HMGB1是否通過上調(diào)SREBP-1表達(dá)誘導(dǎo)MMC細(xì)胞的脂質(zhì)沉積，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細(xì)胞隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組（control）；HMGB1（0．1 mg／L）刺激組（HMGB1組）；HMGB1＋sh-SREBP-1組和 HMGB1＋空質(zhì)粒組，于HMGB1刺激8 h時(shí)收集細(xì)胞。

1．3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染（具體步驟按照說明書進(jìn)行）。將常規(guī)培養(yǎng)的 MMC細(xì)胞（融合80%）時(shí)分為正常對(duì)照組、單純刺激組、刺激＋空質(zhì)粒組和刺激＋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（2．0μg DNA＋4μl Lipofectamine 2000／2 ml無血清培養(yǎng)基），轉(zhuǎn)染12 h后單純刺激組、刺激＋空質(zhì)粒組和刺激＋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中分別加入 IFN-γ（500 IU／ml）或 HMGB1（0．1 mg／L），于刺激8 h時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1．4 油紅O染色檢測(cè)MMC細(xì)胞中脂質(zhì)沉積

將4%多聚甲醛固定的細(xì)胞取出后浸泡入PBS中5 min，油紅O染色15 min，異丙醇分化液中分化數(shù)秒，蒸餾水沖凈，淡蘇木素染色5 min，沖凈后甘油明膠封片。

1．5 蛋白印記（Western blot）檢測(cè) MMC細(xì)胞中HMGB1、SREBP-1和FAS蛋白的表達(dá)

收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，低溫下加入約5倍體積的裂解緩沖液，冰上裂解 30 min，低溫高速離心（4℃、12 000 r／min、20 min），上清液即為所提取的蛋白溶液。采用考馬斯亮藍(lán)試劑法進(jìn)行蛋白定量。等量蛋白（50μg）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉 37℃封閉 2 h，加入兔抗 HMGB1（1∶1 000）、SREBP-1（1∶400）、鼠抗 FAS（1∶500）和β-actin（1∶1 000）抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后以HPR標(biāo)記的 IgG二抗（1∶5 000）37℃封閉 2 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光成像。底片透掃后以LabWorks 4．5軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，目的蛋白表達(dá)以目的條帶和βactin條帶積分光密度值的比值（IOD值）代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1．6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中 HMGB1、SREBP-1和FASmRNA表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。取等量RNA，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，TaqDNA聚合酶催下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后進(jìn)入凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）進(jìn)行吸光度掃描，以管家基因β-actin作為內(nèi)參照校正，用目的基因的吸光度和β-actin吸光度的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

Tab．1 Primers and product for HMGB1，SREBP-1，F(xiàn)ASandβ-actin

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用多重比較的方差分析。

2 結(jié)果

2．1 IFN-γ能夠誘導(dǎo)MMC細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)增多

油紅O染色顯示正常組MMC細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)明顯脂滴，而IFN-γ刺激組8 h時(shí)MMC細(xì)胞即可以出現(xiàn)紅染脂滴顆粒，刺激12 h紅染的脂滴顆粒與8 h相比沒有明顯的變化（圖1）。

2．2 IFN-γ 能夠上調(diào) MMC細(xì)胞中 HMGB1、SREBP-1和FASmRNA及蛋白表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，IFN-γ刺激能夠上調(diào)HMGB1、SREBP-1和FASmRAN的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性（圖2A）。Western blot結(jié)果顯示，與0 h相比，IFN-γ組 HMGB1、SREBP-1和 FAS蛋白表達(dá)明顯升高，呈時(shí)間依賴性，12 h時(shí) HMGB1、SREBP-1和 FAS蛋白的 IOD值分別為（1．79±0．04）；（1．15±0．02）和（0．96±0．09）明顯高于 0 h，2 h，4 h和 8 h（圖2B，P＜0．05）。

Fig．1 Lipid droplets formation in MMCcells induced by IFN-γin MMC cells at 8 h（Oil Red O staining×400）A：Control group；B：IFN-γ group；C：IFN-γ＋sh-HMGB1 group；D：HMGB1＋sh-SREBP-1 group；MMC： Mouse mesangial cells；IFN-γ：Interferon-γ；HMGB1：High mobility group protein 1；SREBP-1：Sterol regulatory element binding protein-1

Fig．2 Expression of SREBP-1，F(xiàn)AS，HMGB1 mRNA and protein in MMCcells detected by RT-PCR and Western blotA：RT-PCR；B：Western Blot；SREBP-1：Sterol regulatory element binding protein-1；FAS：Fatty acid synthetase；HMGB1：High mobility group protein-1**P＜0．05 vs 0 h group

2．3 sh-HMGB1能夠降低 IFN-γ誘導(dǎo)的 MMC細(xì)胞中SREBP-1、FAS蛋白表達(dá)，并且降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

與正常對(duì)照組相比，IFN-γ能夠上調(diào) SREBP-1和 FAS蛋白的表達(dá)；而 IFN-γ＋sh-HMGB1組中SREBP-1和FAS蛋白表達(dá)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 3，P＜0．05）。油紅 O染色顯示，在IFN-γ刺激組MMC細(xì)胞的胞漿中可見明顯的紅染的脂滴顆粒，但在IFN-γ＋sh-HMGB1組中未見明顯的紅染脂滴顆粒（圖1）。

Fig．3 Expression of SREBP-1 and FASprotein in MMCcells detected by Western blot A：Western blot；B：Densitometric scanning；1：Control；2：IFN-γ；3：IFN-γ＋sh-HMGB-1；4：IFN-γ＋sh-Scramble*P＜0．05 vs control； ＃P＜0．05 vs IFN-γ

2．4 沉默SREBP-1表達(dá)能夠降低HMGB誘導(dǎo)的MMC細(xì)胞中SREBP-1蛋白表達(dá)和脂質(zhì)沉積

與對(duì)照組相比，HMGB刺激能夠上調(diào)MMC細(xì)胞SREBP-1和FAS蛋白表達(dá)，刺激8 h時(shí)達(dá)高峰，12 h稍有下降，并伴有細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（圖 4）；采用siRNA技術(shù)沉默MMC細(xì)胞中SREBP-1表達(dá)能夠減少HMGB誘導(dǎo)的FAS蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（圖1）。

3 討論

狼瘡性腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡重要的并發(fā)癥，其伴有多種臨床表現(xiàn)如高血脂、糖代謝異常、高血壓等。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡性腎炎患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎組織中可見脂質(zhì)沉積并且伴有血脂升高；我們的前期實(shí)驗(yàn)也顯示，狼瘡性腎炎患者和BXSB鼠（狼瘡鼠模型）16周時(shí)均可出現(xiàn)血脂升高，油紅O染色發(fā)現(xiàn)在腎組織中可見紅染的脂滴顆粒，因此我們推斷，狼瘡性腎炎發(fā)病過程中伴有腎組織的脂質(zhì)沉積，但其機(jī)制如何，目前尚不清楚。

目前大多觀點(diǎn)認(rèn)為，狼瘡性腎炎的發(fā)生與免疫系統(tǒng)功能異常、各種細(xì)胞因子分泌及表達(dá)紊亂有關(guān)。多種細(xì)胞因子共同作用參與了腎炎的發(fā)生。γ-干擾素是狼瘡性腎炎發(fā)病過程中重要的細(xì)胞因子，且在疾病早期就可以出現(xiàn)［5］，具有多種生物學(xué)功能。為了闡明狼瘡性腎炎發(fā)病過程中脂質(zhì)沉積的可能機(jī)制，本研究以 IFN-γ為刺激物，油紅 O染色觀察MMC細(xì)胞中脂質(zhì)沉積的情況，結(jié)果顯示，IFN-γ刺激組MMC細(xì)胞的胞漿中可見明顯的紅染的脂滴顆粒，提示IFN-γ能夠誘導(dǎo)MMC細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)沉積。

HMGB1參與了多種免疫性疾病的發(fā)生過程。HMGB1作為一種核蛋白被首次發(fā)現(xiàn)。同時(shí)其作為炎性因子和免疫佐劑的作用受到了更多的重視。HMGB1可由單核巨噬細(xì)胞釋放，同時(shí)可在LPS、TNF-α等炎性因子刺激下由受損細(xì)胞或壞死細(xì)胞釋放，并反過來作用于受損細(xì)胞，促使更多炎性因子釋放并發(fā)揮作用，從而放大了炎癥反應(yīng)。目前研究顯示，胞外的HMGB1是一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［8，9］。我們的前期實(shí)驗(yàn)顯示，HMGB1是狼瘡性腎炎發(fā)病過程中重要的細(xì)胞因子［10］，但其是否參與 IFN-γ介導(dǎo)的 MMC細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。SREBPs屬于螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指（bHLH-Zip）轉(zhuǎn)錄因子家族，其包括SREBP-1和 SREBP-2，SREBP-1基因位于17號(hào)染色體，有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，其mRNA長(zhǎng)度約為4 154 bp，翻譯的成熟片段分子量為 68 kD，SREBP-1可調(diào)控脂肪酸和甘油三酯的合成［6］。我們的前期研究顯示，SREBP-1參與高脂飲食引起的腎臟小管細(xì)胞脂質(zhì)沉積［7］。但其是否參與HMGB1誘導(dǎo)的MMC細(xì)胞脂質(zhì)沉積目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)，IFN-γ能夠提高體外培養(yǎng)的MMC細(xì)胞HMGB1mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)SREBP-1及其下游基因FASmRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高，沉默HMGB1后能夠顯著降低IFN-γ誘導(dǎo)的SREBP-1和FAS蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。

本研究還發(fā)現(xiàn)：重組HMGB1能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SREBP-1和 FAS蛋白表達(dá)；采用 siRNA技術(shù)沉默SREBP-1表達(dá)后，F(xiàn)AS蛋白表達(dá)降低，且細(xì)胞中紅染的脂滴顆粒明顯減少。

因此，綜上所述，我們認(rèn)為上調(diào)HMGB1／SREBP／FAS表達(dá)是IFN-γ介導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞脂質(zhì)沉積的可能機(jī)制之一。

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