王亮亮綜述，劉強和審校

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣西桂林 5 41001)

老年性耳聾是伴隨年齡老化(一般發(fā)生在60歲以上)而發(fā)生的聽覺系統(tǒng)退行性變導致的耳聾，主要為感音神經(jīng)性聾，它的發(fā)生與耳部微血管退化、耳蝸病變、聽覺神經(jīng)元、聽覺中樞、聽覺傳入傳出神經(jīng)通路及全身機能退化密切相關，但是，目前國內(nèi)外學者普遍認為耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞或者耳蝸毛細胞的萎縮退變是老年聾的關鍵因素［1-3］。彭斌等［4］的研究說明耳蝸底回的傳出神經(jīng)末梢已受到年齡的影響，這種影響可能源自老化導致的外毛細胞的缺失，因為毛細胞是對聽神經(jīng)元的發(fā)生和保持正常起著重要作用的多種營養(yǎng)因子的來源。所以，毛細胞的缺失必然會使聽神經(jīng)纖維和聽神經(jīng)元變性。由此可見，抑制耳蝸毛細胞和耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的退變對老年性耳聾的防治有重要價值。目前老年性耳聾的藥物治療和外科手術治療只能改善部分癥狀，長期療效并不樂觀［5］。近年來，隨著對疾病細胞分子水平研究的不斷深入，細胞移植的替代治療成為探索疾病治療的新途徑并被大量關注。而骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromalstem cells，BMSC)以其自我更新［6］和多向分化能力［7］被廣泛應用于移植研究中，特別是對于一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退化性病變，更是成為研究的熱點。

1 BMSC的特性

BMSC作為探討細胞水平治療疾病的主要來源之一，具有其自身的優(yōu)勢，如分化潛能好、來源豐富、不存在胚胎干細胞移植所帶來的倫理學問題，又可用于自體移植，免除了宿主可能的免疫排斥反應，具有良好的應用前景［8］。近年來，隨著對分子生物學研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)骨髓中除造血干細胞外，還存在BMSC。BMSC是中胚層分化而成的非造血成體干細胞，在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出胚胎干細胞的增殖能力和多向分化潛能。它可分化為各種類型的間充質(zhì)細胞，在適當?shù)臈l件下，BMSC也可跨胚層分化為非間充質(zhì)細胞。近來 Jiang等［9］研究表明BMSC還能產(chǎn)生神經(jīng)細胞。因此，BMSC也許可以用來移植以恢復損傷或者萎縮的毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)的功能。

在生理穩(wěn)態(tài)情況下，體內(nèi)大多數(shù) BMSC增殖不明顯，但在體外補充適量血清的培養(yǎng)液中，它們能貼壁生長，表現(xiàn)出旺盛的有絲分裂活動和增殖能力，同時能多次傳代而保持細胞的表型不變。能夠向內(nèi)皮細胞、外胚層和中胚層分化，植入無損傷的組織能與宿主細胞穩(wěn)定嵌合。與胚胎干細胞相比，BMSC有良好的內(nèi)在組織相容性，能廣泛遷移，與周圍組織整合而發(fā)揮功能，在有免疫缺陷的小鼠體內(nèi)不產(chǎn)生腫瘤，植入反應弱。此外，BMSC在體外能被神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導分化為多種成體細胞，分泌一系列細胞因子，促進神經(jīng)元生長發(fā)育，因此被視為多種組織細胞移植的替代來源及基因治療的有效運載工具，已成為細胞移植與基因治療領域中的研究熱點。選擇BMSC的原因除了它具有以上優(yōu)點外，還因為它易于收集培養(yǎng)，也能夠進行自體移植，可有效地避免或減輕免疫排斥反應;在人體內(nèi)也易進行操作，具有很強的實用性?？梢夿MSC移植治療退行性變引起的疾病有很大的應用潛力，也因此代表了一種有潛能的新的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的策略。

2 BMSC的分離培養(yǎng)

目前常用的分離方法主要有3種，即密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)篩選法及流式細胞儀分選法［10］。其中密度梯度離心法具有操作簡便，所得BMSC純度較高、對活性影響小等特點被廣泛應用。貼壁培養(yǎng)篩選法操作簡單，但獲得的BMSC純度低、混雜細胞較多。流式細胞儀法目前尚未廣泛應用。BMSC的培養(yǎng)目前多采用貼壁細胞培養(yǎng)法。培養(yǎng)條件多采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的 L-DMEM培養(yǎng)基，置于 37% 、5%CO2、80%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3 BMSC移植途徑及在老年性耳聾中的應用

3.1 BMSC的移植途徑

目前內(nèi)耳干細胞移植途徑有鼓階注射［11-12］、中階注射［13］、半規(guī)管開窗注射［14］、蝸軸注射［15-17］等方法，而 BMSC內(nèi)耳移植的文獻較少，相關文獻提示主要是鼓階注射和蝸軸注射。

3.2 BMSC內(nèi)耳移植

內(nèi)耳作為一特殊器官，存在著內(nèi)外淋巴循環(huán)，并且僅通過耳蝸導水管與腦脊液相連通，因此在結(jié)構上相對獨立，為近年來內(nèi)耳轉(zhuǎn)基因治療提供了解剖學基礎。有觀點認為，外淋巴腔和蝸軸的解剖屏障可能對BMSC的遷移起阻隔作用，所以更傾向于蝸軸注射，但Sharif等［11］通過鼓階注射 BMSC，發(fā)現(xiàn)移植細胞除主要分布在鼓階外，還能遷移到螺旋韌帶、骨螺旋板緣、感覺上皮、聽神經(jīng)等部位。用神經(jīng)干細胞通過鼓階移植使藥物進入聾豚鼠耳蝸內(nèi)，可以看到移植細胞可以沿著蝸軸的聽神經(jīng)分布并接近感覺上皮區(qū)［18］?？梢酝茢嗤饬馨颓缓臀伮菪艿慕馄势琳现g可能存在著一種供細胞通過的微小通道，使鼓階注射的干細胞可以沿著該通道到達螺旋神經(jīng)節(jié)，并順著神經(jīng)纖維到達corti氏器附近。

對于內(nèi)耳這一特殊結(jié)構，以前細胞移植替代治療的研究多局限于直接注射神經(jīng)營養(yǎng)因子或以病毒載體、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染神經(jīng)營養(yǎng)因子基因到耳蝸，也有經(jīng)腦脊液途徑的相關報道［19］，但以上載體的安全性、表達特性及效應等問題均有待解決。BMSC的選取、培養(yǎng)方法、分化為神經(jīng)細胞的效率、移植位點、細胞的數(shù)量、腦中內(nèi)源性因子的作用以及BMSC在腦內(nèi)存活時間對移植療效均有一定的影響。魯玲玲等［20］的實驗采用復制缺陷型腺相關病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)染方法將BMSC改造成攜帶酪氨酸羥化酶基因的工程細胞，經(jīng)X-gal染色和酪氨酸羥化酶免疫組化檢測，轉(zhuǎn)染效率為70%以上，表明BMSC易于接受并表達外源基因，可促進多巴胺的合成或在腦內(nèi)定向誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元。2003年日本學者 Iguchi等［14］將來源于綠色熒光轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)干細胞經(jīng)半規(guī)管途徑移植入 C57/BL6小鼠內(nèi)耳中，28 d后發(fā)現(xiàn)干細胞存活，并且已轉(zhuǎn)化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，能夠分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子。說明細胞移植不僅在身體其他組織器官可行，而且在內(nèi)耳這一特殊器官也是可行的。不過，由于胚胎和神經(jīng)干細胞取材困難，在臨床上的應用將受到限制。葛圣雷等［12］選用具有良好的生物活性與多向分化潛能的BMSC，進行內(nèi)耳移植探索性研究，發(fā)現(xiàn)移植的BMSC在耳蝸鼓階成活并貼壁生長，取得可喜的成果。

3.3 BMSC在老年性耳聾中的應用

老年性耳聾是一種隨著年齡增長而出現(xiàn)的退行性病變，其關鍵是聽神經(jīng)元的老化以及凋亡，尋找一種阻滯其退化或者凋亡的治療手段成為治療該疾病的主要研究方向，Jeon等［21］在體外條件下利用生長因子和Math1，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞能夠被誘導成類毛細胞，而Jessica將小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞用包含有GFP、Math1和毛細胞間蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后移植到雞胚中，結(jié)果顯示移植細胞在雞胚中存活，其中一些細胞融合到耳周間充質(zhì)，但不表達任何毛細胞標記物。但有研究證明將含有Math1基因的BMSC移植至耳蝸后，可以看到基底膜支持細胞及鄰近非感覺上皮細胞表達Math1蛋白，分化為類毛細胞，蝸軸的聽神經(jīng)軸突向新生的毛細胞生長并檢測到新生毛細胞有助于聽力提高［22］。Iwai 等［23］研 究 顯 示 BMSC 移 植 能 夠阻止老年性耳聾毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡。Kamiya等［24］采用線粒體毒素造成大鼠耳蝸局部纖維細胞的急性凋亡，然后將培育的BMSC灌注到受損耳蝸小鼠內(nèi)耳外半規(guī)管，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后的BMSC在耳蝸內(nèi)發(fā)生遷移，在損傷區(qū)域外側(cè)壁檢測到移植細胞，檢測聽力有顯著性提高。同樣證明了BMSC移植治療老年性耳聾的成效顯著，有文獻研究表示神經(jīng)生長因子(NGF)對豚鼠損傷的內(nèi)耳毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞有保護作用，Hu等［25］將帶有 NGF的小鼠胚胎的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細胞移植入耳蝸，發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)突穿過耳蝸骨質(zhì)伸向耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)，這一現(xiàn)象證明移植的胚胎神經(jīng)節(jié)能融入到成年的聽覺神經(jīng)系統(tǒng)，進而很有可能治療耳聾。作為耳蝸細胞替代治療的目的主要是替代耳蝸內(nèi)缺失的毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和非感覺細胞。研究表明BMSC能夠向神經(jīng)細胞、毛細胞［26-27］、非感覺細胞分化。目前，通過BMSC移植來進行聽力的功能性恢復已經(jīng)建立，我們還需要進一步的研究來了解 BMSC的移植后分化能力以及它們在內(nèi)耳重建損失細胞中的可能應用［28］。同時試想，將帶有 NGF基因的BMSC移植到耳蝸是否有更好的效果這值得我們進一步研究。

4 展望

神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞移植治療就是將自體、同種異體或異種的有功能的細胞，經(jīng)過加工處理后，移植到患者的腦內(nèi)或脊髓內(nèi)的特定區(qū)域，從而治療某種神經(jīng)疾病的方法。近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞移植對宿主腦區(qū)破壞小，定位準，可重復注射，可準確計算植入細胞的數(shù)量，而且可以混合使用不同腦區(qū)、不同類型的細胞。BMSC具有干細胞共有的特性以及神經(jīng)干細胞和胚胎干細胞不具備的優(yōu)點，被認為是組織工程和細胞替代治療中的最佳選擇。盡管BMSC移植在老年性耳聾的研究方面取得了一定的進展，但是仍然存在一些問題:①如何使體外培養(yǎng)的BMSC能夠更加穩(wěn)定傳代;②是否能夠找到一種更好的方法提高移植后BMSC耳蝸內(nèi)的成活率;③移植后的BMSC向耳蝸毛細胞及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞分化數(shù)目、存活時間不確定，而且其是否有向腫瘤細胞發(fā)展的傾向;④BMSC移植治療老年性耳聾長期療效還需要進一步研究。構建神經(jīng)生長因子基因修飾的BMSC，同時將其移植入快速老化小鼠的耳蝸，并以此來探討快速老化小鼠在聽功能和耳蝸病理組織學變化等方面及移植效果方面的研究目前在國內(nèi)外均未展開。但運用移植的方法治療退化性疾病已成為一種新的研究方向。老年性耳聾嚴重威脅人類身心健康，隨著我國步入老齡化社會，該疾病的發(fā)病人數(shù)處在上升階段，針對老年性耳聾的細胞移植治療的方法給該疾病的治療帶來了新的希望。

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