徐莉莉 浙江省金華市金東區(qū)中醫(yī)院中藥房 金華 321031

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硫磺熏制對杭白菊總黃酮含量的影響

徐莉莉 浙江省金華市金東區(qū)中醫(yī)院中藥房 金華 321031

杭白菊 硫磺熏制 總黃酮

杭白菊又稱杭菊，是菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，為《中國藥典》所收載[1]，是著名的“浙八味”之一，具有散風清熱，平肝明目、清熱解毒功效，用于風熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花，瘡癰腫毒等癥，是臨床常用中藥。菊花的主要有效成分為黃酮、三萜、揮發(fā)油等[2]，菊花總黃酮具有抗氧化[3-4]、降血壓、擴張冠狀動脈[5-7]等作用，是杭白菊主要藥效物質，具有較大的藥用和保健價值。

硫磺熏蒸是一種在中藥材及飲片的加工和貯藏過程中應用較為普遍的加工方法，具有干燥、防蟲、防霉以及增白等作用[8]，但是由于硫磺熏蒸使杭白菊殘留大量的二氧化硫，且導致有效成分的化學結構和含量發(fā)生改變[9-10]，影響杭白菊臨床應用的安全性和有效性。本實驗采用可見紫外分光光度法測定杭白菊硫磺熏制前后總黃酮含量，為優(yōu)化杭白菊的炮制加工方法提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 試劑與藥材 蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號100080-201106）；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉為分析純。杭白菊：采集于浙江桐鄉(xiāng)，經金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院羅國海副教授鑒定為菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的新鮮頭狀花序；分別采用傳統(tǒng)蒸制干燥、一次硫磺熏制、二次硫磺熏制法制備成杭白菊干燥品，粉碎，過2號篩備用。

1.2 儀 器 VU-265FM紫外可見分光光度計（日本島津），HH-6型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），XP205電子分析天平（瑞士梅特勒托利多）。

2 實驗方法與結果

2.1 對照品溶液和供試品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品約25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20mL，置50mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得（每1mL中含無水蘆丁0.224mg）。取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇50mL，稱重，回流提取1h，放涼，稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 最大吸收波長的選擇 精密吸取蘆丁對照品溶液和杭白菊供試品溶液各1mL，分別置于25mL量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應試劑為空白，于400～600nm掃描，結果在504nm處有最大吸收。

2.3 標準曲線的制備 精密吸取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于25mL容量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應試劑為空白，立即照紫外-可見分光光度法（2010版中國藥典一部附錄ⅤA），于504nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得吸光度Y與蘆丁濃度X的回歸方程:A=9.486X+0.04，R2=0.9990。

2.4 提取工藝優(yōu)選 通過預試驗及相關文獻研究發(fā)現(xiàn)，影響杭白菊總黃酮提取的主要因素有提取方法、乙醇濃度、溶劑用量和提取時間。因此，對四個因素進行單因素考察。

2.4.1 提取方法 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，分別置100mL圓底燒瓶中，精密加入50%乙醇50mL，稱重，分別超聲30min、60min，回流30min、60min，放涼，稱重，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液1mL，分別置25mL量瓶中，照“2.3標準曲線的制備”項下的方法，自“加70%乙醇至6mL”起依法測定吸光度，計算，即得。結果分別為，超聲30min含量為6.25%、60min為6.63%，回流30min為6.84%、60min為7.15%，結果表明，回流提取的黃酮含量高于超聲提取，因此，選擇回流為杭白菊總黃酮提取方法。

2.4.2 乙醇濃度考察 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，分別精密加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇50mL，稱重，回流提取，放涼，稱重，用相應濃度的乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述述方法進行測定。結果乙醇濃度在50%～80%范圍內時，測得總黃酮含量較高，且乙醇濃度為70%時，測得的總黃酮含量最高，為8.36%。因此，將乙醇濃度確定70%。

2.4.3 提取時間考察 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇各50mL，稱重，分別回流提取0.25、0.5、1和1.5h，放涼，稱重，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進行測定。結果發(fā)現(xiàn)隨著回流時間的延長總黃酮含量增加，當回流時間大于1h時，總黃酮含量增加不明顯，因此，將提取時間確定為1h。

2.4.4 溶劑用量考察 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，分別精密加入70%乙醇40、50、60和70mL，稱重，分別回流提取1h，放涼，稱重，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進行測定。結果發(fā)現(xiàn)，當溶劑超過50 mL時，總黃酮含量變化不大。因此，確定溶劑用量為50 mL。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取對照品溶液4mL，供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，同“2.4標準曲線的制備”項下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，測定吸光度，測定六次。對照品溶液及供試品溶液吸光度的RSD分別為0.21%和0.18%，說明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液4mL，供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，同“2.4標準曲線的制備”項下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，每隔10min測定一次吸光度。對照品溶液及供試品溶液吸光度的 RSD分別為 2.22%和2.39%，RSD均小于3%，結果表明對照品溶液和供試品溶液顯色后在1h內穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 分別取杭白菊粉末6份，照“2.2對照品溶液和供試品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法操作，照前述含量測定方法進行測定，測得總黃酮含量平均值為8.39%，RSD值為1.36%，表明本法重復性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 采用加樣回收法試驗。取已知總黃酮含量的杭白菊0.25g，精密稱定，共取6份，分別準確加入蘆丁對照品適量，照“2.2對照品溶液和供試品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法操作，制備成供試品溶液，照前述含量測定方法進行測定，計算回收率。試驗結果表明，蘆丁平均回收率為99.6%%（n=6），RSD為2.63%。說明測定結果準確。結果見表1。

2.6 樣品測定 分別稱取杭白菊傳統(tǒng)蒸制干燥、一次硫熏、二次硫熏樣品粉末三份，每份0.5g，精密稱定，照“2.2對照品溶液和供試品溶液的制備”項下供試品溶液制備方法操作，照前述含量測定方法進行測定。結果見表2。

3 討 論

通過對杭白菊總黃酮含量的測定發(fā)現(xiàn)，硫磺熏制與傳統(tǒng)蒸制干燥的杭白菊相比黃酮含量有較大幅度的下降，一次熏制下降約25%，二次熏制下降接近40%。在總黃酮的含量測定中，利用Al（NO3）3溶液與黃酮絡合顯色，鋁離子與4-羰基、5-羥基或4-羰基、3-羥基絡合，在堿性條件下呈紅色，在510nm左右有最大吸收。而硫熏過程中，產生的大量二氧化硫，可能與酚羥基發(fā)生反應，生成亞硫酸酯，從而難以與鋁離子產生絡合，可能是硫磺熏制后總黃酮檢測結果大幅降低的原因。

總黃酮為杭白菊主要有效部位，具有抗氧化、降血壓、擴張冠狀動脈等作用，是杭菊主要藥效物質。黃酮類成分一般含有酚羥基，是其發(fā)揮藥理活性的重要官能團。硫熏過程中，酚羥基可能發(fā)生酯化，從而使黃酮類成分喪失相應的藥理作用，降低療效。

本試驗結果提示應當限制硫磺熏蒸在杭白菊加工過程中的使用，應采用化學手段對硫磺熏制后黃酮類化學成分的變化進行確認，并對總黃酮硫熏后的毒理作用、藥理活性進行考察，為確定杭白菊更合理的加工炮制方法提供科學依據。

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2013-04-12