劉曉莉，劉懷民 ，高啟龍，陳小兵，張成娟，楊 峰

1)河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科鄭州450008 2)河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科鄭州450008 3)河南省腫瘤醫(yī)院病理科鄭州450008#通訊作者，男，1970年3月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:消化道腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合治療，E-mail:lhm1970311@126.com

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，以手術(shù)為主的綜合治療是其主要治療手段; 但食管癌化療的效果并不理想，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高。靛玉紅是傳統(tǒng)中成藥當(dāng)歸龍薈丸中青黛的抗腫瘤有效成分，其衍生物靛玉紅甲肟(分子式為C16H11N3O2，相對(duì)分子質(zhì)量為277.3)是具有新型結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥。靛玉紅及其衍生物可抑制人體多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［1］。作者的前期研究［2］發(fā)現(xiàn)靛玉紅甲肟可抑制食管癌EC-1 和Kyse70 細(xì)胞增殖，但具體分子機(jī)制尚不完全明確。該研究觀察了靛玉紅甲肟對(duì)人食管癌EC9706 細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響，初步探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 靛玉紅甲肟購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，取5 mg 溶于1 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，配成18 mmol/L 的母液，過濾除菌備用。甲基噻唑藍(lán)(MTT)及DMSO、胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)液。EC9706 細(xì)胞系購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) EC9706 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 用2.5 g/L 胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL－1，接種于96 孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h，貼壁后棄去上清，分別加入濃度為0、1、5 及10 μmol/L 的靛玉紅甲肟，每組5 個(gè)復(fù)孔; 繼續(xù)培養(yǎng)12、24 及48 h后，MTT 法測(cè)增殖抑制率，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=(對(duì)照組A 值－實(shí)驗(yàn)組A 值)/對(duì)照組A 值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) EC9706 細(xì)胞用10 μmol/L 靛玉紅甲肟作用0、24、48、72 h 后，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化收集，吹打制備單細(xì)胞懸液，保證每管細(xì)胞數(shù)至少達(dá)1×106個(gè)。將100 μL 細(xì)胞懸液加入5 mL培養(yǎng)管中，加入Annexin V-FITC 和活細(xì)胞染料PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 Sox-2 mRNA 檢測(cè) 分別用濃度為0、1、5 及10 μmol/L 的靛玉紅甲肟作用于EC9706 細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞，利用RNeasy Mini 試劑盒提取細(xì)胞RNA 并純化，用一步法RT-PCR 試劑盒對(duì)提取的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，上PCR 機(jī)擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后，采用Gel Doc 2000TM凝膠圖像分析儀采集圖片，用Quantity One 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。Sox-2上游引物序列5’-TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA-3’，下游引物序列5’-CTGGGGCTCAAACTTCTCTC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為76 bp。內(nèi)參β-actin 上游引物序列5’-CAACGCGAACCGCGAGAAGATG-3’，下游引物序列5’-GTCGAGGGCGACGTAGCAGAGG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為330 bp。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以目的條帶與β-actin 條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 數(shù)據(jù)處理，采用4×3 析因設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行分析，采用單因素方差分析對(duì)各組細(xì)胞凋亡率和Sox-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 靛玉紅甲肟對(duì)EC9706 細(xì)胞增殖的影響 增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可以看出，隨著靛玉紅甲肟濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，EC9706 細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增加，呈劑量和時(shí)間依賴性。

表1 各組EC9706 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定結(jié)果(n=5)%

2.2 靛玉紅甲肟對(duì)EC9706 細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)10 μmol/L 靛玉紅甲肟作用后，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，0、24、48 和72 h 的凋亡率分別為(2.7±1.5)%、(10.4±1.3)%、(19.1±1.4)%和(29.3± 2.6)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =195.350，P ＜0.001)。

2.3 靛玉紅甲肟對(duì)EC9706 細(xì)胞Sox-2 mRNA 表達(dá)的影響 RT-PCR 結(jié)果見圖1。0、1、5 和10 μmol/L 靛玉紅甲肟作用48 h 后，EC9706 細(xì)胞Sox-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.974± 0.059)、(0.720±0.042)、(0.657± 0.074)和(0.401±0.039)，逐漸下降(F=87.552，P ＜0.001)。

圖1 靛玉紅甲肟作用后EC9706 細(xì)胞Sox-2 mRNA 的表達(dá)

3 討論

靛玉紅作為抗腫瘤的有效成分已應(yīng)用多年，有研究［2-3］表明，靛玉紅可抑制多種腫瘤細(xì)胞的體外增殖，還可增加其他抗癌藥物對(duì)耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，臨床療效可靠，對(duì)骨髓無明顯抑制作用。目前其衍生物靛玉紅甲肟的抗腫瘤作用越來越受到重視。

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及化療耐藥是總體生存率不高的主要原因。在對(duì)食管癌EC-1 細(xì)胞體外生長(zhǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，研究者［2］發(fā)現(xiàn)靛玉紅甲肟與奈達(dá)鉑聯(lián)用可以增強(qiáng)對(duì)EC-1 細(xì)胞的殺傷作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著靛玉紅甲肟濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，EC9706 細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增大; 靛玉紅甲肟作用后EC9706 細(xì)胞的凋亡率也逐漸增大，并呈時(shí)間依賴性;提示靛玉紅甲肟體外能抑制EC9706 細(xì)胞的增殖，并可有效誘導(dǎo)其凋亡。

Sox 家族參與胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，決定細(xì)胞的歸宿，對(duì)多種組織器官的發(fā)育具有重要作用，并參與人類性別的決定［4］。在胚胎干細(xì)胞(ES 細(xì)胞)中，Sox-2 呈高度表達(dá)狀態(tài)，它標(biāo)志著ES 細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞(TS 細(xì)胞)具有保持未分化的全能性［5］，Sox-2 轉(zhuǎn)錄水平在一定程度上決定著ES 和TS 細(xì)胞的分化方向和自我更新能力［6］。在某些疾病中，Sox基因被發(fā)現(xiàn)可能直接參與或協(xié)助癌癥的發(fā)生［7-8］。Li 等［9］認(rèn)為Sox-2 蛋白的過量表達(dá)與胃癌的發(fā)生有關(guān)。作者的前期研究［10］發(fā)現(xiàn)，靛玉紅甲肟能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖并可降低其Sox-2 的表達(dá)，且具有時(shí)間和劑量依賴性。該研究結(jié)果顯示，靛玉紅甲肟濃度從1 μmol/L 升至10 μmol/L 時(shí)，EC9706 細(xì)胞Sox-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，表明靛玉紅甲肟可抑制EC9706 細(xì)胞中Sox-2 mRNA 的表達(dá)，該作用具有量效關(guān)系。由此推斷，抑制Sox-2 的轉(zhuǎn)錄可能是靛玉紅甲肟抑制EC9706 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制之一。

綜上所述，靛玉紅甲肟對(duì)食管癌EC9706 細(xì)胞具有明顯的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Sox-2 mRNA 的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用途徑和分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。目前，常規(guī)化療對(duì)TS 細(xì)胞作用微弱。靛玉紅甲肟能抑制TS 細(xì)胞中Sox-2 等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)這一特性，可能為特異性殺滅TS 細(xì)胞提供了一條新的思路。

［1］吳琦瑋，葛忠良，高月，等.靛玉紅對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究及相關(guān)機(jī)制探討［J］.天津中醫(yī)藥，2008，25(1):55

［2］陳小兵，張軍輝，羅素霞，等.靛玉紅甲肟對(duì)奈達(dá)鉑抗人食管癌EC-1 細(xì)胞的化療增效作用［J］.腫瘤防治研究，2009，36(11):914

［3］Shi J，Shen HM.Critical role of Bid and Bax in indirubin-3’-monoxime-induced apoptosis in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(9):1729

［4］Niwa H，Miyazaki J，Smith AG.Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation，dedifferentiation or self-renewal of ES cells［J］.Nat Genet，2000，24(4):372

［5］Carlin R，Davis D，Weiss M，et al.Expression of early transcription factors Oct4，Sox-2 and Nanog by porcine umbilical cord (PUC)matrix cells［J］.Reprod Biol Endocrinol，2006，4:8

［6］袁虎，王秋菊，韓東一.SOX 家族基因的功能及其研究進(jìn)展［M］.國(guó)外醫(yī)學(xué):遺傳學(xué)分冊(cè)，2005，28(6):332

［7］Katoh M.Expression of human SOX7 in normal tissues and tumors［J］.Int J Mol Med，2002，9(4):363

［8］Xia Y，Papalopulu N，Vogt PK，et al.The oncogenic potential of the high mobility group Box protein Sox3［J］.Cancer Research，2000，60(22):6303

［9］Li XL，Eishi Y，Bai YQ，et al.Expression of the SRY-related HMG box protein SOX2 in human gastric carcinoma［J］.Int J Oncol，2004，24(2):257

［10］劉曉莉，樊青霞，曹婧，等.靛玉紅甲肟對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞系體外生長(zhǎng)抑制的研究［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(27):62