王燕煌，郭曉霞，黃曉晶，江山

（福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓教研室，福建省高校口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350002）

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）是目前公認(rèn)的引起根管治療失敗的主要致病菌［1］，有效清除根管內(nèi)E.faecalis感染是現(xiàn)階段牙體牙髓治療的研究重點(diǎn)之一。光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一門新技術(shù)目前已逐漸進(jìn)入口腔科研工作者的視野。PDT由三要素組成，包括光源、光敏劑和氧，三者缺一不可。良好的光源是PDT不可缺少的條件，光源的存在使得光動(dòng)力反應(yīng)得以順利進(jìn)行?，F(xiàn)階段PDT的研究重點(diǎn)主要集中在新型光敏劑的研發(fā)，有關(guān)光源的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少，且主要集中在光照劑量及功率密度等方面［2］，這可能是由于以往對(duì)光照發(fā)射方式的重要性認(rèn)識(shí)不足。實(shí)際上，PDT療效除取決于光敏劑給藥劑量和光照劑量外，還取決于對(duì)光照方式的把握。光導(dǎo)纖維作為激光傳播介質(zhì)，在光動(dòng)力反應(yīng)中的重要性不可忽略。目前有關(guān)PDT根管消毒時(shí)光照方式的研究主要包括兩方面：將光導(dǎo)纖維置于根管內(nèi)照射或根管口照射［3］，其中前者研究相對(duì)較多?？紤]到根管內(nèi)照射存在一定局限性，如增加實(shí)驗(yàn)操作的繁冗性以及由于需要特別定制符合根管內(nèi)徑的光導(dǎo)纖維而增加實(shí)驗(yàn)成本，故有必要尋求一種簡(jiǎn)便、有效且能將其應(yīng)用于根管復(fù)雜環(huán)境中的光照方式。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外建立牛牙E.faecalis根管感染模型，比較不同光照方式對(duì)PDT抗菌效應(yīng)的影響，旨在探討光照方式在光動(dòng)力反應(yīng)中的重要性，為今后研究PDT對(duì)根管E.fae－calis感染的抗菌效應(yīng)奠定技術(shù)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌：E.faecalis國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC33186），美國(guó)菌種保藏中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣本：小牛恒切牙。

1.1.3 光敏劑：亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB），購(gòu)自美國(guó)Sigama Aldrich公司，光敏劑避光保存與操作。

1.1.4 主要試劑及材料：2.5%次氯酸鈉溶液，購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；17%EDTA溶液，購(gòu)自江西凱隆化工有限公司；PBS，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；吸潮紙尖40#，購(gòu)自北京達(dá)雅鼎醫(yī)療器械有限公司；無(wú)菌消毒包，將實(shí)驗(yàn)用鋪巾、托盤(pán)、眼科專用鑷、吸潮紙尖等物品打包，121℃、1.5 MPa、15 min高溫高壓滅菌。

1.1.5 主要儀器與設(shè)備：SAS-DL3醫(yī)用激光治療儀，購(gòu)自北京壽安山責(zé)任有限公司；平端面光纖，工作端直徑1 mm，用于根管口照射，購(gòu)自南京春暉科技實(shí)業(yè)有限公司；柱狀光纖，工作端直徑400 μm，長(zhǎng)度10 mm，用于根管內(nèi)照射，購(gòu)自南京飛帝斯光纖機(jī)械電子工程制作中心；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，購(gòu)自德國(guó)Human公司；冷凍高速離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；XL-30掃描電鏡，購(gòu)自荷蘭飛利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 光敏劑配制：取149.6 mg MB粉末溶于20 mL PBS中，光敏劑終濃度為100 μmol/L。制備完成后，用孔徑0.22 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，置于4℃冰箱避光保存。

1.2.2 建立牛牙E.faecalis根管感染模型

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)樣本選擇與制作 收集新鮮拔除的完整小牛恒切牙30顆，要求牙根無(wú)裂痕、無(wú)齲壞、根尖孔發(fā)育完全。去除牙根周圍的牙結(jié)石和牙周膜后，將樣本放入生理鹽水中4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用牙科高速手機(jī)在流水冷卻下沿釉牙骨質(zhì)界處切除牙冠，保留牙根長(zhǎng)度為20 mm，拔除根髓后，以不銹鋼K-file（登士柏公司）按標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行根管預(yù)備。根管的工作長(zhǎng)度以根管長(zhǎng)度減l mm，即約19 mm為標(biāo)準(zhǔn)，根管均預(yù)備至80#。根管預(yù)備過(guò)程中每更換大一號(hào)銼用2.5%次氯酸鈉溶液5 mL勻速?zèng)_洗根管，根管預(yù)備完成后用17%EDTA溶液沖洗根管1 min，以去除玷污層，最后用生理鹽水做最終沖洗，將所有樣本置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。隨機(jī)抽取6個(gè)樣本進(jìn)行掃描電鏡觀察，確定根管壁玷污層基本去除干凈，牙本質(zhì)小管口開(kāi)放。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)樣本消毒滅菌 將制作好的樣本分別放入含10 mL腦心浸液液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，于121℃、1.5 MPa、15 min高溫高壓滅菌。然后將裝有樣本及腦心浸液液體培養(yǎng)基的玻璃試管放厭氧箱中培養(yǎng)48 h后取出，肉眼觀察，若腦心浸液液體培養(yǎng)基仍保持透明，則認(rèn)為滅菌效果可靠。

1.2.2.3 菌株活化 凍存的E.faecalis標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)復(fù)蘇、傳代，厭氧培養(yǎng)（37 ℃，80%N2，10%CO2，10%H2）48 h，經(jīng)染色鏡檢證實(shí)為純培養(yǎng)后，挑起3～5個(gè)單菌落接種于5 mL液體腦心浸液培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌混懸液離心（4000 r/min，10 min），棄上清，懸浮菌體于PBS中，調(diào)節(jié)菌液濃度D（630）=1.0，含菌量約為3.5×109CFU/mL。

1.2.2.4 建立E.faecalis根管感染模型 將上述配制好的E.faecalis菌液接種于無(wú)菌離體牙根管內(nèi)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液，厭氧培養(yǎng)28 d后隨機(jī)選取6個(gè)樣本進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)，確定E.faecalis根管感染模型成功建立［4］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：將建模成功后的18個(gè)牛牙樣本隨機(jī)分為2組，每組9個(gè)樣本。根管口照射組：實(shí)驗(yàn)根管注入濃度為100 μmol/L的MB（注入量以平齊根管口為準(zhǔn)），光敏劑靜置孵育10 min后將直徑為1 mm的平端面光纖置于根管口照射5 min；根管內(nèi)照射組：實(shí)驗(yàn)根管注入濃度為100 μmol/L的MB（注入量以平齊根管口為準(zhǔn)），光敏劑靜置孵育10 min后將直徑為400 μm、工作長(zhǎng)度為10 mm的柱狀光纖置于根管內(nèi)距根尖1 mm的位置，由下往上照射根管5 min。2組實(shí)驗(yàn)所選激光器波長(zhǎng)為670 nm，光纖輸出功率經(jīng)過(guò)統(tǒng)一校正后，均設(shè)置為50 mW。

1.2.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)：所有牛牙樣本均在實(shí)驗(yàn)前、后取樣，將2根40#無(wú)菌紙尖置于根管內(nèi)，停留1 min，取樣液，立即放入裝有l(wèi) mL PBS的Eppendorf管中，小型振蕩器振蕩1 min，用取樣槍吸取Eppendoff管中100 μL液體，10倍比系列稀釋，取100 μL稀釋樣本分別接種于腦心浸液瓊脂平皿上，培養(yǎng)24～48 h后計(jì)算菌落形成單位（CFU/mL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果按lg（菌落形成單位）做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，用SPSS17.0軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較每組根管內(nèi)E.faecalis在實(shí)驗(yàn)前后菌落形成單位的變化，組間差異采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 牛牙E.faecalis根管感染模型成功建立

厭氧培養(yǎng)第28天，隨機(jī)選取6個(gè)樣本進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)觀察到E.faecalis密集浸潤(rùn)于牙本質(zhì)小管內(nèi)，即E.faecalis根管感染模型成功建立。見(jiàn)圖1。

2.2 不同光照方式介導(dǎo)的PDT對(duì)牛牙E.faecalis根管感染的抗菌效應(yīng)

根管口照射組實(shí)驗(yàn)前菌落形成單位為（7.322 7±0.0215），實(shí)驗(yàn)后為（5.9980±0.060 7）；根管內(nèi)照射組實(shí)驗(yàn)前菌落形成單位為（7.3121±0.024 9），實(shí)驗(yàn)后為（5.917 7±0.1023）。經(jīng)PDT處理后，2組根管內(nèi)E.faecalis數(shù)目較實(shí)驗(yàn)前均顯著下降（P＜0.05），但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

E.faecalis在根管內(nèi)的致病機(jī)制目前尚未完全明了，如何有效去除根管內(nèi)E.faecalis感染對(duì)提高臨床根管治療成功率具有重要意義。以往研究發(fā)現(xiàn)，將光導(dǎo)纖維置于根管內(nèi)照射可以對(duì)感染的E.faecalis產(chǎn)生較強(qiáng)光敏效應(yīng)［5］。但該方法增加了操作的繁冗性，且由于根管內(nèi)徑較細(xì)小需要特別定制符合根管尺寸的光導(dǎo)纖維，因而增加治療成本。另外，在彎曲根管的應(yīng)用中，由于材料柔韌性能受限，使用不當(dāng)將可能引起光導(dǎo)纖維折斷。因此，尋求一種便捷、有效、具有較低技術(shù)敏感性的光照方法已成為學(xué)者們致力解決的目標(biāo)之一。

現(xiàn)階段隨著技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)療專用輸出光纖頭研制技術(shù)日趨成熟，人類對(duì)輸出光纖頭的選擇亦隨之增多。目前，常見(jiàn)的輸出光纖頭有平端面光纖、球形光纖以及柱狀光纖，其選擇主要取決于病變組織的部位及形狀。PDT用于根管消毒時(shí)，選取平端面光纖將其置于根管口照射將使操作簡(jiǎn)便化，但其抗菌效應(yīng)如何，結(jié)果尚未得知。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)選取平端面光纖和柱狀光纖，觀察比較2種不同光照方式介導(dǎo)的PDT對(duì)根管內(nèi)E.faecalis感染是否具有相同抗菌效應(yīng)。另外，為了使實(shí)驗(yàn)具有可比性，本研究中2種不同光導(dǎo)纖維的輸出功率經(jīng)過(guò)統(tǒng)一校正后均設(shè)定為50 mW，即激光總能量均為15 J。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在光照能量統(tǒng)一的情況下，將光導(dǎo)纖維置于根管口照射及根管內(nèi)照射對(duì)E.faecalis的抗菌效應(yīng)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），這與Nunes等［3］的研究結(jié)果一致，該實(shí)驗(yàn)中所選的樣本為長(zhǎng)度15 mm的單根管離體牙。而本實(shí)驗(yàn)所選的樣本為小牛恒切牙，其根管較直，且所有牙根均較長(zhǎng)，統(tǒng)一定長(zhǎng)為20 mm。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，對(duì)于長(zhǎng)度在20 mm以內(nèi)的直根管的治療，PDT抗菌效應(yīng)不受光導(dǎo)纖維在根管內(nèi)位置的影響。而對(duì)于臨床常見(jiàn)的彎曲根管、超長(zhǎng)根管，選擇根管口照射方式是否亦能達(dá)到有效抗菌，未來(lái)仍需通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。

盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2種光照方式介導(dǎo)的PDT對(duì)根管內(nèi)E.faecalis均具有殺傷作用，但仍不能達(dá)到完全滅菌的效果，推測(cè)這與光敏劑的性能有一定關(guān)聯(lián)。MB作為本實(shí)驗(yàn)所選光敏劑，其很重要的一個(gè)物理特性是在水溶液中為聚合狀態(tài)。由于MB在水溶液中容易形成二聚體，而二聚體對(duì)MB的光物理特性影響很大，可影響活性氧簇的生成，因而降低光敏效應(yīng)［7］。另外，由于光動(dòng)力反應(yīng)中起核心作用的活性氧簇其半衰期較短，在水溶液中壽命僅為4 μs，且其作用半徑較短，只有10～20 nm，因此作用范圍有限，僅能破壞鄰近的細(xì)胞結(jié)構(gòu)［8］，而以往的研究證實(shí)E.faecalis在牙本質(zhì)小管內(nèi)的浸潤(rùn)深度可深達(dá)1000 μm［9］，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)未能達(dá)到完全滅菌可能與PDT作用深度不能到達(dá)細(xì)菌在牙本質(zhì)小管內(nèi)的感染深度有關(guān)聯(lián)。再則本實(shí)驗(yàn)所選的光照時(shí)間為5 min，光照參數(shù)參考以往的文獻(xiàn)［10］，推測(cè)與該時(shí)間范圍內(nèi)的光照處理尚不能使本實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)菌發(fā)揮至最佳敏感狀態(tài)有關(guān)聯(lián)。當(dāng)然，這一推斷還有待于后期的研究證實(shí)。

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