李少一，高蕓，劉宏宇，王國棟，李曉東，馬維寧，劉云會

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，沈陽110001）

膠質(zhì)瘤是人腦最常見的惡性腫瘤，約占40.49%，膠質(zhì)瘤的特點是侵襲性強(qiáng)且容易復(fù)發(fā)。微小RNA（microRNA或miRNA）是指長度約21～25 nt的某些特殊的小型非編碼RNA組成的家族，這些miRNA能夠識別特定的目標(biāo)mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)靶mRNA的降解和（或）抑制翻譯過程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用［1］。近年來，其研究已經(jīng)從基礎(chǔ)研究迅速上升到臨床研究，研究證實miRNA參與諸多基因激活和失活的調(diào)節(jié)，逐漸成為腫瘤、心血管、免疫、炎癥等疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子標(biāo)志［2～4］。miRNA作為腫瘤標(biāo)志物，對預(yù)測人膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后的相關(guān)研究還需要深入解析。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是主動過程，該過程可以概括為3個步驟：（1）腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分黏附；（2）腫瘤細(xì)胞釋放或誘導(dǎo)釋放蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)；（3）降解區(qū)域腫瘤細(xì)胞在趨化因子引導(dǎo)下遷移。腫瘤細(xì)胞必須啟動并成功地完成所有這些步驟才能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)，形成遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移［5，6］。為了深入研究侵襲轉(zhuǎn)移步驟的機(jī)制，研究者建立了一些體外侵襲模型用于評估不同腫瘤細(xì)胞的侵襲活性［7，8］。為了深入了解轉(zhuǎn)移相關(guān)性miRNA表達(dá)的改變對人膠質(zhì)瘤淋巴轉(zhuǎn)移的影響，我們從人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G中用Transwell侵襲小室技術(shù)通過體外篩選，建立了高侵襲性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞亞群（命名為T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3）。通過分析其在軟瓊脂中集落形成情況，比較幾種細(xì)胞亞群的體外集落形成能力，并采用miRNA芯片技術(shù)分析膠質(zhì)瘤中與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的miRNA表達(dá)譜，旨在篩選與膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的miRNA。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G購自ATCC，細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2 Transwell體外侵襲實驗篩選高侵襲性的細(xì)胞亞群

用Transwell侵襲小室根據(jù)T98G細(xì)胞的侵襲性差異把他們分成不同細(xì)胞亞群。即用一種重新溶解配成原來濃度的基膜凝膠涂鋪Transwell有小插孔的聚碳酸酯膜（含8 μm孔）。將T98G細(xì)胞（5×104/孔）接種于Transwell小室上室，高侵襲性細(xì)胞消化基質(zhì)膠后穿過Transwell小室聚碳酸酯膜上8 μm小孔進(jìn)入小室下室，于37°C放置48 h后，收集高侵襲性細(xì)胞群。分別選出3個細(xì)胞亞群T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3。那些沒有移行至Transwell小室下室，停留在上室的細(xì)胞群，作為對照細(xì)胞命名為T98G-4C-1、T98G-4C-2和T98G-4C-3。

1.3 軟瓊脂集落形成實驗

1×103個對數(shù)生長期T98G細(xì)胞懸浮于含0.3%軟瓊脂的完全培養(yǎng)液中，播種于1%底層軟瓊脂上（100 mm組織培養(yǎng)皿），放置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中2周后，計數(shù)可見集落。

1.4 miRNA芯片分析

用Trizol（Invitrogen公司）提取RNA，委托博奧生物公司進(jìn)行miRNA芯片分析。采用LuxScan10K激光共聚焦掃描儀掃描雜交芯片，并用LuxScan3.0軟件分析表達(dá)譜。采用Partek Genomics Suite分析表達(dá)譜結(jié)果，P<0.05、Fold Change>2為差異表達(dá)miRNA。

2 結(jié)果

2.1 T98G細(xì)胞亞群的成瘤性比較

利用Transwell小室，根據(jù)其侵襲性的差異，將人類的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98G分為2個不同的細(xì)胞亞群。穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞作為高侵襲性的細(xì)胞亞群（T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3）。而那些留在小室上室的細(xì)胞亞群作為對照組（T98G-4C-1、T98G-4C-2和T98G-4C-3）。用體外集落形成實驗來檢測選定的細(xì)胞亞群的成瘤性。如圖1所示，在軟瓊脂上的T98G-4M-1、T98G-4M-2和T98G-4M-3細(xì)胞亞群，形成的集落數(shù)量分別是對照組的2.7、3.4和3.2倍。

2.2 與人膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的miRNA表達(dá)譜

為了解析參與調(diào)控膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的miRNA，我們分析了高侵襲性細(xì)胞亞群與對照組的表達(dá)有差異的miRNA。如表1顯示，高侵襲性細(xì)胞亞群與對照細(xì)胞亞群比較，采用Partek Genomics Suite分析表達(dá)譜結(jié)果，有11個miRNA的表達(dá)有顯著差異（P<0.05，F(xiàn)old Change>2），其中5個miRNA的表達(dá)上調(diào)（let-7b、miR-200A、miR-222、miR-106 和 miR-193）和6個miRNA的表達(dá)下調(diào)（mir-199B、mir-26A、mir-34、miR-29、mir-15A 和 mir-16）。

3 討論

至今我們對腫瘤惡性轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移演變過程的了解還很有限，本研究采用Transwell侵襲小室，從人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98G中篩選出高侵襲及轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，Transwell侵襲小室的體外篩選是一個可行的方法，能夠分離不同惡性程度的細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞亞群可用于進(jìn)一步評估膠質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究。為了鑒別miRNA表達(dá)譜有顯著差異，我們通過微點陣分析3個不同的高侵襲性亞群和對照亞群，并獲得了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA差異表達(dá)圖譜。本研究所用的所有細(xì)胞系均來自同一母細(xì)胞系，因此他們有相同的遺傳背景，但有不同轉(zhuǎn)移潛能。當(dāng)我們比較侵襲性亞群和對照亞群時，我們鑒別出11個差異性調(diào)節(jié)miRNA。在高轉(zhuǎn)移的細(xì)胞亞群與對照組間，已確定存在差異表達(dá)的11個 miRNA 中，有 9個 miRNA（let-7b、mir-222、mir-106、mir-193、mir-34、mir-29、mir-26a、mir-15a 和mir-200）在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的進(jìn)展中及間質(zhì)上皮的轉(zhuǎn)變發(fā)揮了重要作用［9～12］；而mir-199B和mir-16分別涉及腫瘤干細(xì)胞的分化及凋亡［13，14］。

miRNA在不同組織、不同發(fā)育階段中的表達(dá)水平有顯著差異，miRNA表達(dá)模式具有分化的位相性和時序性，而且miRNA作為一種廣泛存在的對基因表達(dá)進(jìn)行微調(diào)的分子，通過網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控方式，可以從整體上調(diào)控有機(jī)體的生命活動。在本研究中我們獲得了關(guān)于轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA差異表達(dá)的相關(guān)信息，提示這些miRNA可能顯著影響腫瘤轉(zhuǎn)移及惡性轉(zhuǎn)化。因此需要進(jìn)一步研究以確定miRNA差異表達(dá)的分子機(jī)制，并探究這些miRNA如何促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

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