徐愛華，王維，商秀麗

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.康復(fù)醫(yī)學(xué)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。記憶障礙，尤其是近記憶障礙，是AD典型的首發(fā)征象，隨后出現(xiàn)遠(yuǎn)記憶受損、時(shí)間及空間定向障礙，晚期多伴有人格改變，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。在所有與年齡相關(guān)的癡呆中，AD約占50%［1］。隨著社會老齡化的發(fā)展，估計(jì)到2050年我國65歲及以上老人約占總?cè)丝诘?5%，80歲及以上老人約占22%，AD患者預(yù)期可達(dá)2500萬，將成為影響家庭和社會發(fā)展的一個(gè)重要制約因素，因此必須對其進(jìn)行積極防治。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是腦內(nèi)廣泛存在的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。海馬CA3區(qū)是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的腦功能區(qū)，也是BDNF及其受體TrkB在腦內(nèi)表達(dá)最集中的部位［2］。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)BDNF mRNA及蛋白表達(dá)較正常人腦明顯降低［3］，同時(shí)相應(yīng)腦區(qū)突觸素的表達(dá)也明顯降低，說明二者之間可能存在著某種聯(lián)系，共同在AD發(fā)病中起作用。因此，我們通過對大鼠海馬CA3區(qū)立體定位注射岡田酸（okadaic acid，OA）建立模擬AD的大鼠模型，再用外源性BDNF對其作用，觀察外源性BDNF對腦內(nèi)突觸素表達(dá)的影響以及對大鼠行為學(xué)的作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康成年雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購自沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，濕度70%，自然通風(fēng)，自然光照，大鼠可自由接觸食水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：OA（美國Upstate公司），BDNF（美國 Chemicon公司），突觸素抗體、K252a、LY294002、pThr231抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組：60只大鼠隨機(jī)平均分為正常對照組、假手術(shù)組、OA組、BDNF組、K252a組和LY294002組。

1.2.2 動物模型制作：大鼠用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，沿顱頂正中線切開皮膚，暴露頭骨，按照大鼠腦立體定位圖譜定位：AP-3.8 mm，ML±3.8 mm，DV 4.0 mm，即為海馬CA3區(qū)注射點(diǎn)。假手術(shù)組大鼠每側(cè)海馬注射2 μL生理鹽水；OA組每側(cè)海馬注射2μL OA（0.2 μmol/L）；BDNF 組每側(cè)注射2μL OA+2 μL BDNF（50 ng/mL）；K252a 組每側(cè)注射2μL OA+2 μL BDNF+2 μL K252a （0.2 μmol/L）；LY294002 組每側(cè)注射2μL OA+2 μL BDNF+2 μL LY294002（0.2 μmol/L）。

1.2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 定位航行試驗(yàn) 歷時(shí)4 d，每天上、下午各2次，將大鼠面向水迷宮池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠找到平臺所需要的時(shí)間，即逃避潛伏期。如大鼠在2 min內(nèi)找不到平臺，則由試驗(yàn)者將其引向平臺，其潛伏期為120 s。每次訓(xùn)練間隔為60 s。

1.2.3.2 空間探索試驗(yàn) 定位航行試驗(yàn)結(jié)束后撤除平臺，然后將鼠任選一個(gè)點(diǎn)放入水中，測其2 min內(nèi)跨越原平臺所在位置的次數(shù)及游泳軌跡。

1.2.4 標(biāo)本采集：用于免疫組化檢測的動物用10%水合氯醛300 mg/kg經(jīng)腹腔注射進(jìn)行麻醉，然后開胸暴露心臟，先用生理鹽水經(jīng)左室心尖插管快速灌注，再用4%多聚甲醛溶液（pH 7.2～7.4）持續(xù)灌注約300 mL，至大鼠四肢變硬后斷頭取腦，并于4%多聚甲醛中后固定48 h。用于Western blot檢測的動物，用水合氯醛深度麻醉后直接斷頭取腦，于冰盒上快速分離雙側(cè)海馬組織，放入1.5 mL Eppendorf管中，立即-80℃凍存。

1.2.5 Western blot：將凍存的組織融化。4℃裂解細(xì)胞，離心15 min，取上清。應(yīng)用酚試劑法測定樣本中蛋白濃度。將電泳后的硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)印液中浸泡數(shù)分鐘后，轉(zhuǎn)印2 h。用含10%脫脂奶粉的封閉液封閉，4℃過夜。將封閉過夜的膜取出，加入p38（1∶1000）及 pThr231（1∶1000），室溫 4 h。將一抗孵育后的膜用TTBS洗5 min，2次，然后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000），室溫2 h。二抗洗膜后，在暗室將熒光劑A液B液等量混勻后，立即加到膜上，反應(yīng)1 min，將膜固定到曝光盒中，曝光1～5 min，依次顯影定影，比照曝光板上的膜記錄下marker和各條帶的位置。將蛋白印記顯影圖掃描，利用圖像分析軟件Scion Image對蛋白帶進(jìn)行光密度分析。以β-actin作為內(nèi)對照，將每一個(gè)蛋白帶的光密度值與相應(yīng)內(nèi)對照β-actin蛋白帶的比值作為所測蛋白的半定量指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 定向航行試驗(yàn)

OA組及K252a組大鼠逃避潛伏期較正常組、假手術(shù)組、LY294002組及BDNF組明顯延長（P<0.01）；BDNF及LY294002組大鼠逃避潛伏期較正常組及假手術(shù)組也明顯延長（P<0.01）。見表1，圖1。

2.2 空間探索試驗(yàn)

OA組及K252a組大鼠跨越平臺次數(shù)較正常對照組、假手術(shù)組、LY294002組及BDNF組明顯減少（P<0.01）；BDNF 組、LY294002組、正常對照組及假手術(shù)組比較，大鼠跨越平臺次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1，圖2。

2.3 突觸素表達(dá)

正常對照組、BDNF組及LY294002組突觸素表達(dá)較OA組和K252a組增高（P<0.01），但正常對照組、BDNF組及LY294002組3組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖3。

2.4 pThr231表達(dá)

OA組、LY294002組和K252a組pThr231表達(dá)較正常對照組及BDNF組明顯增多（P<0.01），但OA組、LY294002組及K252a3組3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；BDNF組與正常對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖4。

3 討論

突觸作為神經(jīng)系統(tǒng)的特征性組織結(jié)構(gòu)之一，是神經(jīng)元之間相互作用的基本結(jié)構(gòu)單位，是記憶形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究表明，突觸丟失是AD早期腦內(nèi)一個(gè)重要的病理學(xué)特征［4］。突觸素是突觸終末特異性標(biāo)記物，構(gòu)成突觸囊泡特異性膜通道，參與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)與排放。突觸素密度與AD癡呆嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［5］。我們在實(shí)驗(yàn)中用OA對大鼠海馬CA3區(qū)進(jìn)行立體定位注射，引起了大鼠顯著的空間記憶障礙，海馬突觸素蛋白及其mRNA表達(dá)明顯減少，tau蛋白Thr231位點(diǎn)過磷酸化。我們認(rèn)為大鼠空間記憶障礙主要是由突觸結(jié)構(gòu)及功能異常引起的，而tau蛋白的過磷酸化及神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏是引起突觸結(jié)構(gòu)功能異常的主要原因。一方面，OA可直接導(dǎo)致tau過磷酸化；另一方面，BDNF及其受體的缺乏可引起PI-3K/AKT通路的失活，GSK-3β表達(dá)上調(diào)，增加tau蛋白的過磷酸化［6］。過磷酸化的tau蛋白可引起微管聚合、組裝、穩(wěn)定性及功能異常，從而可導(dǎo)致突觸形成、生長、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等多方面障礙，使得突觸素表達(dá)減少。突觸素表達(dá)的減少意味著突觸數(shù)量的減少、突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)能力的下降、突觸傳遞功能的減弱，由此可引起神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞、加工和儲存障礙，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能減退。

許多研究證明，BDNF通過對突觸生長、突觸可塑性及突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用，在認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶形成中起重要作用［7］。BDNF在突觸可塑性的突觸前和突觸后機(jī)制中都是必需的，并且對記憶形成所必需的長時(shí)程增強(qiáng)的形成及保留［8］都是必需的。在細(xì)胞水平，BDNF被證明可增加突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)現(xiàn)有的突觸運(yùn)輸，并能增加突觸形成［9］；在分子水平，BDNF增加β-連環(huán)蛋白酪氨酸殘基的磷酸化，減少鈣黏蛋白-β-連環(huán)蛋白黏著復(fù)合物的解離［10］，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。本研究應(yīng)用外源性BDNF后，tau蛋白Thr231位點(diǎn)過磷酸化減少，海馬突觸素蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高，大鼠空間認(rèn)知明顯改善。說明外源性BDNF確實(shí)可通過減少tau蛋白磷酸化、增加突觸形成、改善突觸結(jié)構(gòu)和功能等多重途徑在記憶形成和保留過程中起著重要作用。

我們將TrkB受體抑制劑K252a與BDNF同時(shí)海馬內(nèi)注射，BDNF的所有作用都被減弱，說明BDNF的生物學(xué)效應(yīng)是以其受體TrkB為基礎(chǔ)的。BDNF與TrkB受體結(jié)合后將其激活，后者又可通過自動磷酸化引起MAPK、PI-3K等通路的激活［11］。研究證明，TrkB在調(diào)節(jié)海馬齒狀回神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)中起著重要作用，特異敲除TrkB的小鼠突觸前及突觸后結(jié)構(gòu)都發(fā)生了改變，共同影響皮質(zhì)對齒狀回細(xì)胞的聯(lián)合輸入，并對CA3區(qū)的錐體細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)反饋抑制［12］。研究中我們發(fā)現(xiàn)，PI-3K抑制劑LY294002存在時(shí)BDNF使tau蛋白去磷酸化作用減弱，但BDNF提高突觸素表達(dá)及其對大鼠行為學(xué)的改善并沒受影響，說明這一作用是不依賴于或不僅依賴于PI-3K/AKT通路的。

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