劉笑涵，吳琳，張勁松，高勇，鐘鳴

（1.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科，遼寧省口腔醫(yī)學(xué)研究所，沈陽110002；2.中國科學(xué)院金屬研究所，沈陽110016；3.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽110002）

近年來，具有良好生物相容性和安全性的人工關(guān)節(jié)的開發(fā)已成為研究的熱點(diǎn)［1］。鈦材料因其低密度、良好的耐腐蝕能力、比強(qiáng)度高以及令人滿意的生物相容性成為應(yīng)用最為廣泛的人工關(guān)節(jié)材料，但鈦材料的低表面硬度，低抗磨損能力，制約了其發(fā)展［2］。而TiC化合物具有很高的硬度和耐磨性，將TiC加入鈦材料除了可進(jìn)一步提高材料的比彈性模量、比強(qiáng)度和抗蠕變能力外，最明顯的是提高鈦材料的耐磨性能。TiC/Ti復(fù)合泡沫材料（TiC/Ti）為生物惰性材料，為了增加其表面活性，制備了表面經(jīng)氧化處理的TiC/Ti（TiO2/TiC/Ti）和表面經(jīng)ZSM-5分子篩修飾的TiC/Ti（ZSM-5/TiC/Ti）。本課題組前期研究證實(shí)泡沫碳化硅（SiC）具有良好的生物相容性［3］，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞生長［4］，并且有良好的骨傳導(dǎo)性［5］。本實(shí)驗(yàn)以SiC為陰性對照，將TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti、ZSM-5/TiC/Ti材料與SiC進(jìn)行比較，研究這3種實(shí)驗(yàn)材料對細(xì)胞增殖和分化的影響，旨在為新型人工關(guān)節(jié)材料的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

實(shí)驗(yàn)分為 4 組：TiC/Ti組、TiO2/TiC/Ti組、ZSM-5/TiC/Ti組、陰性對照SiC組。4種材料均為直徑14 mm、厚2 mm的圓片，平均孔徑1mm，孔隙率80%（中國科學(xué)院金屬研究所制備）。用75%乙醇超聲清洗，40 Hz，5 min，烘干，高溫高壓（134 ℃、0.21 MPa）滅菌處理。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將滅菌處理后的4種材料分別加入培養(yǎng)液，置于 CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)24 h，制備出材料浸提液［6］，試件浸提量與試樣質(zhì)量比為0.2 g/mL［7］。將濃度為1×104/mL 的 L929細(xì)胞（由中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供）懸液接種于96 孔板，每孔100 μL，每組10 孔。培養(yǎng)24 h，PBS 沖洗后，分別用A～E組液體置換，培養(yǎng)1，3，5 d后取出。加入50 μL/孔濃度為5 mg/mL的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去原液，加入150 μL/孔的 DMSO［8］，振蕩10 min，在免疫酶儀上以550 nm波長測定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞的相對增殖度（RGR）：RGR=實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/陰性對照組平均光密度值×100%。

1.2.2 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：將滅菌備用的4組材料置入24孔培養(yǎng)板中，將濃度為2×104/mL的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3（由中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供）懸液，接種到各樣品表面，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)1，3，5 d后取出，用0.l mol/L的PBS漂洗后放入2.5%戊二醛中固定24 h，1%鋨酸固定1 h，然后將試樣再次用PBS漂洗，隨后依次乙醇系列梯度脫水、CO2臨界點(diǎn)干燥、噴金后［9］，在掃描電子顯微鏡（Quanta600，中國科學(xué)院金屬研究所）觀察材料表面細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.3 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）含量測定：將2×104/mL的MC3T3成骨細(xì)胞懸液接種于24孔板的各組材料表面，分別培養(yǎng)1，3，5 d后，將細(xì)胞消化下來，超聲破碎儀破碎后，取樣。用ALP試劑盒（南京凱基生物公司）檢測ALP含量，以酶聯(lián)免疫檢測儀在520 nm處測定光密度值（optical delnsity，OD）。依據(jù)公式 ALP（U/gprot）=測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管含酚的量（0.003 mg）/取樣量中的蛋白（g），計(jì)算MC3T3的平均ALP活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖結(jié)果

結(jié)果可見，L929細(xì)胞在3種材料浸提液中均能生長，且隨時間的延長而不斷增多。TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti、ZMS-5/TiC/Ti組和SiC組間細(xì)胞量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)比較分析，與SiC比較，在1 d 時，TiO2/TiC/Ti＞SiC（P ＜0.05），而 TiC/Ti、ZSM-5/TiC/Ti組的細(xì)胞量與SiC相近（P>0.05）；在3 d時，SiC＞ZSM-5/TiC/Ti（P ＜0.05），TiC/Ti＞SiC（P ＜0.05），TiO2/TiC/Ti組的細(xì)胞量與SiC組相近（P＞0.05）；在5 d 時，TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti＞SiC（P ＜0.05），SiC＞ZSM-5/TiC/Ti（P＜0.05），見表1。

與SiC組比較，TiC/Ti組增殖率和增殖速度隨時間延長而逐漸升高；TiO2/TiC/Ti增殖率不斷升高，增殖速度在3 d時減緩后加快；而ZSM-5/TiC/Ti增殖率低于SiC，而且增殖速度不斷下降，見表2。

2.2 細(xì)胞黏附試驗(yàn)

掃描電鏡觀察可見：3種實(shí)驗(yàn)材料與陰性對照SiC組表面均有MC3T3細(xì)胞黏附，并隨觀察時間的延長而逐漸增多，貼壁伸展的MC3T3細(xì)胞表面具有許多突起，并伸出較多的絲狀、纖維狀偽足，有的細(xì)胞將偽足伸向孔徑的內(nèi)部，細(xì)胞間靠偽足相連，3 d開始出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而5 d可見明顯的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，細(xì)胞包繞在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞邊界逐漸模糊。3種實(shí)驗(yàn)材料表面上黏附的MC3T3細(xì)胞形態(tài)與陰性對照SiC組沒有明顯差別，見圖1。

2.3 ALP含量結(jié)果（表3）

結(jié)果可見，隨時間延長，各組ALP含量逐漸增加。TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti、ZMS-5/TiC/Ti組和 SiC 組間ALP含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。經(jīng)單因素方差分析，組間比較ALP含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)比較分析，與SiC組比較，ALP含量在1 d時，TiC/Ti稍高于 SiC，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），TiO2/TiC/Ti＞SiC（ P＜0.05），SiC＞ZSM-5/TiC/Ti（P ＜0.05）；在3 d 時，TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti＞SiC（P ＜0.05），SiC＞ZSM-5/TiC/Ti（P ＜0.05）；在5 d 時，TiC/Ti＞SiC（P＜0.05），TiO2/TiC/Ti稍高于 SiC，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05），SiC＞ZSM-5/TiC/Ti（P ＜0.05）。

3 討論

從細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附和ALP含量測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，3種實(shí)驗(yàn)材料的生物相容性與SiC比較，TiC/Ti和 TiO2/TiC/Ti均優(yōu)于 SiC，ZSM-5/TiC/Ti低于SiC。研究表明：鈦材料表面的TiC涂層能夠提高材料表面穩(wěn)定性、植入材料的生物相容性［10］及成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞在植入體表面的黏附［11］，這可能是本實(shí)驗(yàn)中TiC/Ti促進(jìn)細(xì)胞增殖以及成骨細(xì)胞分化的原因。TiO2涂層可增加材料的比表面積，提高材料表面的生物活性［12］，其納米級表面，相對于微米級表面會吸附更多的蛋白，成骨細(xì)胞的吸附率很高［13］，而且TiO2涂層在潮濕的環(huán)境下，表面會形成一些活性羥基，這些Ti-OH基團(tuán)可以成為Ca、P離子的沉積位點(diǎn)［14］，因此推斷TiC/Ti表面氧化處理形成的TiO2/TiC/Ti有利于細(xì)胞的增殖和分化，但是由于Ti-OH基團(tuán)形成鈣、磷離子沉積位點(diǎn)需要一定的時間，有可能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速率由慢到快。TiC/Ti表面經(jīng)ZSM-5分子篩修飾后形成的ZSM-5/TiC/Ti具有較高的熱穩(wěn)定性、抗酸性、水熱穩(wěn)定性、優(yōu)良的催化性能［15］及良好的生物相容性，但是可能由于在高溫或存在高溫水蒸汽的環(huán)境中，硅鋁分子篩出現(xiàn)骨架脫鋁現(xiàn)象使分子篩的活性下降、不穩(wěn)定［16］，使細(xì)胞增殖的速率變緩，細(xì)胞分化能力低于SiC。

綜上所述，TiC/Ti、TiO2/TiC/Ti及其降解產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，具有良好的生物相容性，加上其優(yōu)良的耐磨性能和機(jī)械性能，作為人工關(guān)節(jié)材料具有可行性，而ZSM-5/TiC/Ti還需進(jìn)一步探討及研究。

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