金銀珍，劉智宏，王鶴佳，黃耀凌，張聰敏

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

酰胺醇類抗生素除其代表藥物——氯霉素外，還有甲砜霉素和氟苯尼考(氟甲砜霉素)。但是由于氯霉素存在嚴(yán)重的副作用，國際上相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素，目前出現(xiàn)了用甲砜霉素和氟苯尼考替代氯霉素使用的趨勢［1－2］。甲砜霉素和氟苯尼考屬廣譜抑菌藥物，具有較高的抗菌活性，主要用于治療畜、禽腸道、呼吸道等細(xì)菌性感染［3］，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。但是甲砜霉素仍有免疫抑制作用，其使用有引起耐藥性細(xì)菌存在的風(fēng)險，除我國和日本外，歐盟和美國均將甲砜霉素禁用于食品動物。我國規(guī)定甲砜霉素在各種動物組織中的最高殘留限量(MRL)為50 μg/kg，氟苯尼考?xì)埩魳?biāo)示物為氟苯尼考胺，其在不同動物肌肉組織中的 MRL 為 100 ～300 μg/kg［4］。

已報道的動物組織中甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩魴z測方法有氣相色譜法［5－6］、氣相色譜 － 質(zhì)譜法［7］、高效液相法和高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［8］及甲砜霉素和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫檢測方法［9－11］。本研究以本試驗室建立的甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法為基礎(chǔ)，應(yīng)用能穩(wěn)定分泌抗甲砜霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，可為甲砜霉素及氟苯尼考胺檢測試劑盒提供長期穩(wěn)定的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 酶標(biāo)讀數(shù)儀，SUNRISE，TECAN公司;臺式高速冷凍離心機，Biofuge stratos，Heraeus公司;漩渦振蕩器，MS2，IKA公司;電子天平，Sartorious公司;倒置顯微鏡，Olympus公司;甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備;氟苯尼考胺，TRC公司;聚乙二醇(PEG)4000、氟苯尼考、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Giemsa染料、秋水仙素、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG及羊抗鼠IgG亞類抗體，Sigma公司;DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT及HT，Gibco公司;其他所有化學(xué)試劑均為分析純;檢測抗原為本實驗室自制。

1.1.2 溶液 洗液：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.05%Tween －20，pH 7.2。封閉液：5% 脫脂奶洗液。包被緩沖液：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.5。標(biāo)準(zhǔn)溶液：0、0.2、1、5、25、125 μg/L 甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。底物溶液：0.01%TMB，以0.1 mol/L磷酸鹽－檸檬酸緩沖液(pH 5.0)配制。

1.1.3 動物及細(xì)胞系 Balb/c小鼠，北京實驗動物中心提供;Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 酰胺醇類藥物免疫抗原制備和免疫 免疫抗原的制備及鑒定按文獻(xiàn)［11］進行。以免疫抗原免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠20只，首次免疫用2 mg/mL免疫抗原(以載體蛋白計)1 mL，加等量弗氏完全佐劑乳化，免疫劑量為100 μg/只，于小鼠頸部、背部皮下多點注射。以后與首次免疫相同的劑量加弗氏不完全佐劑進行加強免疫3次，每次間隔2周。于末次免疫后7 d采血，用間接ELISA測定血清效價。選擇抗血清效價高及競爭抑制強的小鼠脾臟進行細(xì)胞融合，融合前3 d腹腔注射加強免疫。

1.2.2 間接競爭ELISA方法的建立 將檢測抗原用碳酸鹽緩沖液稀釋，包被酶聯(lián)板，每孔150 mL，4℃放置過夜。傾去孔內(nèi)液體，拍干，加入洗液250 mL，洗板3次。加入封閉液每孔250 mL，室溫放置2 h，洗液洗板3次。酶標(biāo)板單數(shù)列加入0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，雙數(shù)列加入100 ng/mL濃度甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，取1000倍稀釋的小鼠血清(或細(xì)胞上清液)50 mL分別加到兩濃度的酶標(biāo)板中，室溫孵育1 h。洗液洗板3次，每孔加入羊抗鼠IgG溶液100 mL，室溫孵育30 min。洗液洗板3次。加入底物溶液100 mL，避光顯色10～30 min。加入終止液100 mL，在450 nm波長處測定吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞融合、克隆及腹水制備［12］免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0以5～10∶1的比例混合，用50%PEG作融合劑將兩種細(xì)胞融合，將融合細(xì)胞懸于含20%胎牛血清的2%HAT選擇性培養(yǎng)基內(nèi)，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃下于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在融合后第7～12天，細(xì)胞生長達(dá)1/3～1/4視野時，取融合細(xì)胞的上清液進行篩選。以篩選到與0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液有反應(yīng)，與100 ng/mL濃度甲砜霉素有明顯抑制的細(xì)胞孔進行亞克隆。一般亞克隆后第7～10天再次進行單克隆孔的ELISA篩選，如此亞克隆3～5次，至陽性率達(dá)100%為止。然后進行擴大培養(yǎng)，并將細(xì)胞于液氮下保存。

選取20～22 g雌性Balb/c小鼠20只，腹腔注射0.5 mL液體石蠟7 d后，腹腔注射雜交瘤2×106細(xì)胞，7～14 d后待小鼠腹部顯著膨隆，抽取小鼠腹水，5000 r/min離心5 min，吸出上清液備用。

1.2.4 單克隆抗體類型的鑒定 用1%瓊脂糖磷酸鹽緩沖液制備平板，取小鼠腹水10 mL加到中心孔，加羊抗鼠IgG各亞類抗體10 mL到周邊孔中進行瓊脂擴散試驗，37℃濕盒孵育過夜。

1.2.5 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 按實驗室常規(guī)方法進行［12］。

1.2.6 抗體效價及靈敏度測定 用洗液系列稀釋雜交瘤細(xì)胞上清液及小鼠腹水，按1.2.2項方法操作，取0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值為1.5～1.8的抗體稀釋倍數(shù)作為抗體效價。選擇系列稀釋的甲砜霉素藥物濃度，選擇最佳抗體濃度，按基本間接競爭ELISA進行測定。以甲砜霉素濃度的對數(shù)值為X軸，以各濃度的OD值除以0濃度的OD值(B/B0)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定IC50濃度范圍。

1.2.7 交叉反應(yīng)率 選擇酰胺醇類藥物氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺，分別配成系列濃度，按1.2.2項方法測定，確定IC50濃度。用下式計算各藥物對該抗體的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率=甲砜霉素IC50/待測藥物IC50×100%。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 免疫5次后，采集免疫小鼠血清，用間接競爭ELISA測定小鼠抗血清對藥物的抑制程度，選擇抑制最明顯的2－1號小鼠進行細(xì)胞融合，2塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板全部有雜交瘤細(xì)胞形成，融合率為100%。用間接競爭ELISA檢測細(xì)胞上清液，其中有抑制的為26孔，選其中OD值較高的2個孔進行亞克隆，通過3次克隆化后獲得IC50較低的雜交瘤細(xì)胞株1E及5C，通過傳代、凍存及復(fù)蘇，其雜交瘤細(xì)胞生長良好并能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。

2.2 單克隆抗體特性鑒定結(jié)果

2.2.1 雜交瘤核型鑒定結(jié)果 本試驗獲得的雜交瘤1E染色體數(shù)目為96～102條，平均98條。

2.2.2 抗體類型鑒定 本試驗所制的單克隆抗體雜交瘤1E及5C所分泌的抗體類型為IgG2b。

2.3 靈敏度及效價測定 雜交瘤1E第一代細(xì)胞上清抗體效價為1∶5×103;將細(xì)胞凍存及復(fù)蘇傳代，第二代細(xì)胞上清效價為1∶5×103，腹水抗體效價為1∶1×106。

標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為 0.2、1、5、25、125 μg/L，相應(yīng)的對數(shù)值分別為 －0.7、0、0.7、1.4 及 2.1。IC50變動范圍為15～25 μg/L。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 雜交瘤1E分泌的抗體交叉反應(yīng)率 測定4種藥物的IC50，得出系列交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表1。

表1 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果

3 討論

目前甲砜霉素和氟苯尼考胺殘留檢測主要以儀器方法為主，樣品一般經(jīng)過有機溶劑提取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、除脂肪，再經(jīng)固相萃取柱凈化等步驟進行處理，樣品處理方法比較復(fù)雜，不適合大量樣品檢測的需要。近幾年來，免疫檢測技術(shù)在抗生素、農(nóng)藥、毒素等小分子化合物殘留分析中的應(yīng)用越來越廣泛，而抗體的制備則是建立免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵。甲砜霉素、氟苯尼考與氯霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)的區(qū)別是在基本結(jié)構(gòu)中用甲磺基取代了毒性較強的硝基。為了獲得能抗甲砜霉素及氟苯尼考胺，但不與氯霉素有交叉的抗體，本試驗用碳二亞胺法將氟苯尼考胺與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫抗原［11］，將苯環(huán)上的甲磺基暴露在外作為主要的抗原決定簇，通過小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選、克隆和腹水制備，獲得了抗甲砜霉素、氟苯尼考胺的特異性的單克隆抗體。盡管單克隆抗體的研究技術(shù)比較成熟，但小分子藥物的單克隆與大分子物質(zhì)的抗體制備有明顯區(qū)別，主要因為抗原的免疫原性較弱，且篩選方法不僅要考慮到抗體效價，而且要考慮抑制率高低等因素。合理的篩選程序?qū)δ芊瘾@得高親和力的單抗細(xì)胞株非常重要，本實驗選用自制的檢測抗原，用0濃度及高濃度甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)液進行篩選，獲得了抗甲砜霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。盡管該抗體靈敏度不如本實驗室同期制備的多克隆抗體，但該單克隆抗體效價高，特異性及靈敏度基本能滿足實際檢測要求，可以為今后檢測試劑盒的研發(fā)及生產(chǎn)提供長期穩(wěn)定的抗體。

［1］ 李秀波，石 波，梁 萍.新型廣譜抗菌藥一氟苯尼考［J］.國外畜牧科技，1999，26(3)：50 －52.

［2］ 張建民，鐘超平.獸用廣譜抗生素氟苯尼考的合成［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊，1999，20(2)：68 －71.

［3］ 中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五年版一部［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：14－16.

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［5］ 農(nóng)業(yè)部958號公告－13－2007.《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定——氣相色譜法》［S］.

［6］ Alien P，Pfenning Jose E，Roybal Heidi S Rupp，et al.Simultaneous Determination of Residues of Chloramphenicol，F(xiàn)lorfenicol，F(xiàn)lorfenicol Amine，and Thiamphenicol in Shrimp tissue by Chromatography with Electron Capture Detection［J］.Journal of AOAC International，2000，83(1)：26 －30.

［7］ 農(nóng)業(yè)部958號公告－14－2007.《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定——氣相色譜－質(zhì)譜法》［S］.

［8］ GB/T 207056－2006.《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定——LC－MS－MS》［S］.

［9］ 郝 凱，過世東，胥傳來，等.水產(chǎn)品中甲砜霉素殘留的CELISA檢測方法研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，2：186 －188.

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［11］劉智宏，黃耀凌，汪 霞，等.水產(chǎn)品中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫多殘留測定［J］.中國獸藥雜志，2010，44(12)：1 －5.

［12］ Heddy Zola.單克隆抗體手冊［M］.周宗安.譯.南京：南京大學(xué)出版社，1991.