張 艷，陳 健，陳海華，席 娟，謝小偉，齊君君，伍 勇，孫志良

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128)

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實，具有補肝腎、強筋骨之功效，是多種中獸藥制劑的主要組分，用于提高豬與肉雞的抵抗力、生產(chǎn)性能、以及蛋雞的產(chǎn)蛋率與品質(zhì)［1－4］。女貞子含有多糖、三萜類、環(huán)烯醚萜類和對羥基苯乙醇苷類等多類化學成分，其中，特女貞苷是女貞子的主要有效成分之一［5］。在現(xiàn)行的2010年版《中國獸藥典》中，以特女貞苷作為質(zhì)量控制指標成分，但目前少有文獻報道女貞子中特女貞苷的提取工藝研究，本文采用正交試驗方法，以特女貞苷的含量作為考察指標，優(yōu)選特女貞苷的提取工藝，以期為提高獸藥質(zhì)量標準和新獸藥開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 島津2010AHT高效液相色譜儀(SIL－20A自動進樣器、SPD－20A紫外－可見檢測器、LCSolution工作站)(島津企業(yè)管理(中國)有限公司);Sartorius TE 212－L電子天平，感量0.0001 g(北京賽多利斯公司);KQ－250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 特女貞苷(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號20120213，純度＞98%);女貞子藥材購于湖南中醫(yī)藥大學附屬一院中藥房，并按照2010版《中國獸藥典》進行鑒定，符合標準;水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 特女貞苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC－C18(5 μm，4.6 mm × 150 mm);流動相：甲醇 － 水(40 ∶60);流速 1.0 mL/min;檢測波長 224 nm;柱溫35 ℃;進樣量 10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取特女貞苷適量于容量瓶中，加甲醇定容得濃度為1.0 mg/mL對照品貯備溶液。分別精密量取貯備溶液0.4、0.6、1.0、1.6、2.0 mL 置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得 0.04、0.06、0.10、0.16、0.20 mg/mL 特女貞苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別稱取女貞子20 g，按表2試驗方案安排實驗，提取液濃縮后，減壓干燥得干浸膏，取女貞子提取物干浸膏適量，置于錐形瓶中，加甲醇超聲處理30 min，提取液用0.45 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液即為供試液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件項下的步驟操作，以特女貞苷濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。計算回歸線性方程為Y=6×106X+7580.9，相關(guān)系數(shù)r=0.9997，表明在 0.04 ～0.20 mg/mL 范圍內(nèi)，特女貞苷濃度與峰面積積分值成良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，每個樣品重復測定3次，對照品溶液、供試品溶液的高效液相色譜圖見圖1～圖2，可見特女貞苷峰形較好，與其他峰分離良好。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.2 正交試驗設(shè)計 女貞子的主要藥效成分為水溶性，故以水為提取溶劑，采用加熱回流提取。選用提取次數(shù)(A)、加水量(B)、提取時間(C)為考察因素，根據(jù)預實驗每個因素設(shè)3個水平(表1)，采用L9(34)正交試驗設(shè)計進行實驗安排(表2)，以特女貞苷的含量為考察指標，計算公式為：特女貞苷的含量=特女貞苷提取量/女貞子投料量，計算結(jié)果見表2，并進行相應的結(jié)果分析(表3和表4)［6－7］。從直觀分析可知，影響水提效果的因素主次順序為：A(提取次數(shù))＞C(提取時間) ＞B(加水量)，優(yōu)化水平是A3C3B3，但方差分析結(jié)果表明，A、B、C 3種因素中，只有A(提取次數(shù))與C(提取時間)對特女貞苷含量的影響有顯著性意義(P＜0.05)。為了降低大批量生產(chǎn)成本，最后決定提取工藝為A3B2C3，即加10倍藥材量水提取3次，每次2 h。

表1 因素水平表

表2 正交試驗方案與結(jié)果(n=3)

表3 極差分析表

表4 方差分析表

2.3 驗證試驗 取女貞子20 g，按最佳優(yōu)化工藝A3B2C3進行3批驗證試驗，測得特女貞苷含量為(17.22 ±0.16)mg/g，接近正交試驗方案中的最高值，優(yōu)化條件可行。

3 討論

選擇流動相時，試驗采用了以下4種方法：方法A：乙腈與0.1%磷酸，方法B：甲醇與0.1%磷酸，方法C：甲醇與水，方法D：乙腈與水。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，甲醇與水(40∶60)流動相下樣品中特女貞苷主峰與雜質(zhì)峰分離度最佳，保留時間適中，峰形好，且對泵與色譜柱的損耗小，利于延長色譜柱的壽命。同時所建立的特女貞苷HPLC測定方法，在所用色譜條件下基線穩(wěn)定，具有快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可適用于特女貞苷的定量。

在中藥有效成分的提取方法方面，研究者們采用溶劑提取法、半仿生提取法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法和大孔樹脂吸附法等進行了嘗試，各有優(yōu)劣。本試驗對女貞子中特女貞苷的研究，以特女貞苷及女貞子中大部分有效成分溶于水為出發(fā)點，采用水提法優(yōu)選女貞子的提取工藝，緊盯藥廠生產(chǎn)實際，便于降低成本與推廣應用。

女貞子在畜牧獸醫(yī)上應用廣泛，2010版《中國獸藥典》亦把特女貞苷的含量作為女貞子質(zhì)量評價的標準，實驗結(jié)果表明，正交設(shè)計法對女貞子中特女貞苷提取條件優(yōu)化合理可行，為提高女貞子中特女貞苷提取率提供了實驗基礎(chǔ)，并為提高由女貞子制成的制劑質(zhì)量和進一步開發(fā)新獸藥提供了實驗依據(jù)。

致謝感謝湖南農(nóng)業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新基金對本項目的資助以及湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心的大力支持。

［1］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(二部)二〇一〇年版［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：59.

［2］ 石莉莎，單安山.女貞子調(diào)節(jié)動物免疫功能的研究進展［J］.飼料工業(yè)，2009，30(6)：6 －7.

［3］ 曹國文，張邑凡，陳春林，等.“復方女貞子散”對繁殖母豬生產(chǎn)性能與哺乳仔豬生長性能的影響［J］.飼料工業(yè)，2008，29(10)：4 －5.

［4］ 林 巍，李叔偉，楊鳳微，等.復方女貞子對雛雞抗氧化功能的影響［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45(11)：61 －62.

［5］ 黃新蘋，王武朝.中藥女貞子的化學成分研究進展［J］.國際藥學研究雜志，2011，38(1)：47 －48.

［6］ 張挪威，萬長榮，趙 宏，等.四君子湯提取工藝優(yōu)化研究［J］.中國獸藥雜志，2011，45(6)：1 －4.

［7］ 張 媛，杜洪建，盛柳青，等.正交試驗法優(yōu)化普抗合劑制備工藝［J］.中國獸藥雜志，2007，41(12)：36－37.