王 霞 張?zhí)炝?周惠明

微膠囊化葡萄糖氧化酶對(duì)面團(tuán)氧化作用研究

王 霞1張?zhí)炝?周惠明2

(濰坊醫(yī)學(xué)院1，濰坊 261053)
(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無錫 214122)

以游離葡萄糖氧化酶(GOD)作對(duì)比，根據(jù)面團(tuán)保溫過程中小麥粉濕面筋(WG)含量、水溶性蛋白巰基(W－SH)含量和SDS可溶性蛋白巰基(SDS－SH)的變化，研究以海藻酸鈉－殼聚糖為壁材的微膠囊化葡萄糖氧化酶(CAGC)對(duì)面團(tuán)中—SH的氧化速度及程度;結(jié)合面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性以及電子顯微結(jié)構(gòu)觀察，檢驗(yàn)CAGC對(duì)面團(tuán)面筋結(jié)構(gòu)的改良效果。結(jié)果表明:微膠囊化以后CAGC在面團(tuán)中的氧化速度減慢，作用時(shí)間增長;添加CAGC的面團(tuán)其黏彈性(G*)、回復(fù)性(ε(t))、聚合度(tanδ)及顯微網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均優(yōu)于游離GOD。

微膠囊 葡萄糖氧化酶 濕面筋 流變學(xué) 顯微結(jié)構(gòu)

葡萄糖氧化酶(GOD)是最受關(guān)注的小麥粉改良劑之一，屬強(qiáng)筋劑類，能氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫(H2O2)，后者氧化面筋蛋白中的巰基生成二硫鍵，從而大大改善面筋的組織結(jié)構(gòu)［1－2］。目前，GOD被公認(rèn)為最有可能替代溴酸鉀的酶制劑［2－3］，但仍有諸多不足之處:首先GOD屬于快速氧化劑，催化速度很快，在面團(tuán)形成過程中就已經(jīng)生成了大量的H2O2，后者快速氧化蛋白中的游離—SH，使面團(tuán)變干變硬，導(dǎo)致面制品的品質(zhì)變差［4－6］;其次，GOD在小麥粉介質(zhì)中穩(wěn)定性差，在面團(tuán)形成的前2 min酶活力就損失了25%，接下來的20 min內(nèi)又有20%的酶失活［6－7］，因此GOD的作用效果不夠理想。

試驗(yàn)中的微膠囊化工藝是將芯材GOD包埋于海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊中(CAGC)［8］，使GOD與外界環(huán)境隔離，以提高酶的穩(wěn)定性;同時(shí)通過調(diào)節(jié)微膠囊的壁膜厚度及孔洞大小控制GOD的催化速度，從兩方面改善GOD的作用效果。本試驗(yàn)通過比較保溫過程中CAGC和GOD對(duì)濕面筋含量、水溶性蛋白—SH含量及SDS可溶蛋白—SH含量的影響，研究CAGC在面團(tuán)中對(duì)小麥蛋白的氧化速度，并通過動(dòng)態(tài)流變學(xué)和顯微結(jié)構(gòu)從微觀上驗(yàn)證其改良效果。

1 材料與方法

1．1 材料

中筋粉:“南山”牌超級(jí)粉，江蘇省銀河面粉有限公司?；窘M成成分為:水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)13．3%、粗蛋白10．32%、濕面筋27．4%以及灰分0．60%。葡萄糖氧化酶:“Gluzyme Mono”，酶活力10，000 U/g，丹麥諾維信公司;微膠囊化葡萄糖氧化酶(CAGC)為實(shí)驗(yàn)室自備［8］，酶活力為733 U/g(以CAGC干基質(zhì)量為基準(zhǔn))。三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸鈉(SDS)和其他試劑均為分析純，上海國藥集團(tuán)。

E型粉質(zhì)儀、E型拉伸儀:德國Brabender公司;UV－2800紫外可見分光光度計(jì):尤尼柯儀器有限公司;AR1000動(dòng)態(tài)流變儀:英國TA公司;Quanta－200掃描電子顯微鏡:荷蘭Fei公司。

1．2 方法

1．2．1 濕面筋含量(WG)的測定

5種樣品面團(tuán)分別添加0(空白組)、300 U/kg GOD、300 U/kg CAGC、600 U/kg CAGC或1 000 U/kg CAGC。準(zhǔn)確稱量49．5 g樣品小麥粉置于粉質(zhì)儀50 g面缸中，加入60%的去離子水(含添加酶)，25℃下攪拌3．0 min，將形成的面團(tuán)以保鮮膜包裹，25℃下分別保溫10、30、90 min。以去離子水洗滌面團(tuán)，洗滌過程中不斷用手指壓擠面團(tuán)，反復(fù)壓平、卷疊滾團(tuán)，至用碘液檢查無顏色，稱量濕面筋(WG)的質(zhì)量，精確至0．01 g。

1．2．2 巰基(—SH)含量的測定

面團(tuán)的制備按1．2．1的方法進(jìn)行，25℃下分別保溫10、30、90 min。根據(jù)Beveridge等［9］的方法，Ellman試劑比色測定412 nm處吸光度，以粗蛋白為基準(zhǔn)計(jì)算水溶性蛋白中—SH含量(W－SH)和1．5%的SDS可溶性蛋白中—SH含量(SDS－SH)，單位為μmol/kg。

1．2．3 黏彈特性的測定

通過動(dòng)態(tài)流變儀振蕩模式下的頻率掃描實(shí)驗(yàn)研究CAGC對(duì)面團(tuán)黏彈性的影響。面團(tuán)的制備按1．2．1方法進(jìn)行，25℃靜置保溫30 min。儀器測試條件為:4 cm平板;狹縫距離2 mm;振蕩應(yīng)力30%，應(yīng)變振幅小于1%;掃描頻率0．01～20 Hz;溫度25℃。面團(tuán)在兩板之間再靜置5 min，以松弛殘余應(yīng)力。

1．2．4 蠕變回復(fù)性測定

足球課中，如果學(xué)生能夠自覺的遵守課堂規(guī)則，那么達(dá)到良好的課堂秩序就會(huì)事半功倍。形成良好的自律品質(zhì)需要一個(gè)過程，需要教師不斷對(duì)學(xué)生進(jìn)行教育。1、教師要對(duì)學(xué)生提出明確的要求，進(jìn)行足球課堂紀(jì)律的目的性教育。2、引導(dǎo)學(xué)生正確地看待足球課堂紀(jì)律，產(chǎn)生對(duì)紀(jì)律的積極體驗(yàn)。并且能夠逐步進(jìn)行自我監(jiān)控。3、發(fā)揮集體輿論的作用。積極的集體輿論的形成需要教師的引導(dǎo)。發(fā)動(dòng)學(xué)生參與課堂管理，互相監(jiān)督，互相提醒。

通過動(dòng)態(tài)流變儀靜態(tài)蠕變回復(fù)性實(shí)驗(yàn)研究CAGC對(duì)面團(tuán)黏度和回復(fù)性的影響。面團(tuán)的制備與

1．2．3 相同，儀器測試條件:2 cm平板;狹縫距離2 mm;蠕變過程剪切應(yīng)力50 Pa，保持100 s，回復(fù)過程剪切應(yīng)力0 Pa，測定200 s內(nèi)回復(fù)性;應(yīng)變振幅小于1%;掃描頻率0．01～20 Hz;溫度25℃。面團(tuán)在兩板之間靜置5 min，以松弛殘余應(yīng)力。

1．2．5 面筋顯微結(jié)構(gòu)觀察

面團(tuán)制備按1．2．1的方法進(jìn)行，25℃下保溫90 min，面筋的洗滌方法按1．2．1所述，洗滌后輕輕擠壓并冷凍干燥。面筋樣品用戊二醛固定，采用濺射鍍膜法對(duì)樣品進(jìn)行表面鍍金，然后置于掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2．1 CAGC對(duì)濕面筋含量的影響

圖1給出了不同保溫時(shí)間后各樣品面團(tuán)中WG的變化:隨保溫時(shí)間的延長，空白組WG有下降趨勢，保溫90 min后WG下降4．61%。推測可能的原因?yàn)樾←湻圩陨砗械牡鞍酌?，在小麥粉吸水后被半胱氨酸中的—SH基團(tuán)所激活，分解了面筋中的一部分高分子質(zhì)量蛋白大聚體(GMP)，破壞了面筋結(jié)構(gòu)，使得濕面筋含量下降［10］。另外，保溫過程中面筋蛋白的肽鏈逐漸展開，鏈間部分—S—S—和氫鍵等次級(jí)鍵被打斷，然后與毗鄰的肽鏈又重新鍵合。二硫鍵的打開與重新聚合過程中，部分貧硫蛋白亞基(如ω－醇溶蛋白)不參與面筋網(wǎng)絡(luò)的形成，被洗脫下來，從而導(dǎo)致WG下降［11］。

加入CAGC后3個(gè)保溫時(shí)間段的WG均有所提高，CAGC添加量的增加也有利于WG的增加。對(duì)比添加300 U/kg GOD與300 U/kg CAGC的WG變化可以看出:GOD對(duì)面團(tuán)作用很快，保溫10min后WG達(dá)到28．06%，顯著高于空白組(27．42%)和添加相同酶活力的CAGC組(27．56%)。隨著保溫時(shí)間延長，GOD對(duì)WG的影響減弱，保溫90 min時(shí)的WG僅為27．32%，略低于保溫30 min時(shí)的27．86%。CAGC的氧化速度明顯慢于GOD，其對(duì)WG的影響在保溫過程中逐漸顯現(xiàn)出來。

圖1 CAGC和GOD對(duì)面團(tuán)濕面筋含量的影響

2．2 CAGC對(duì)—SH含量的影響

GOD和CAGC的添加降低了面團(tuán)中W－SH和SDS－SH的含量。兩者對(duì)比可發(fā)現(xiàn):GOD在加水初期氧化—SH的速度非?？?，保溫10 min后面團(tuán)WSH和SDS－SH含量下降幅度(與空白組相比)分別是CAGC組(300 U/kg)的4．8和2．3倍，而隨著保溫時(shí)間的延長，—SH的下降速度變慢;與WG的變化規(guī)律相同，CAGC對(duì)W－SH和SDS－SH的氧化是在保溫90 min內(nèi)逐步完成的，其氧化速度較慢、作用時(shí)間更長、最終的氧化效率更高。

圖2 CAGC和GOD對(duì)W－SH和SDS－SH含量的影響

2．3 CAGC對(duì)面團(tuán)黏彈特性的影響

模量G*=(G'2+G″2)1/2，可體現(xiàn)面團(tuán)的黏彈特性，而損耗角正切值tanδ是彈性模量(G')與黏性模量(G″)的比值，可反映出面團(tuán)中高聚物的比例，tanδ越小體系組分中高聚物的數(shù)量越多或聚合度越大［13］。如圖3所示，面團(tuán)的G*隨CAGC添加量的增加逐漸增高，這表明面團(tuán)的黏彈特性得到改善，面團(tuán)的耐揉性和可操作性變好;同時(shí)tanδ值下降，表明面團(tuán)中高聚物的數(shù)量增多，聚合度增大。近年來大量研究表明，tanδ與面筋蛋白中GMP的含量呈顯著的負(fù)相關(guān)性［11，13］，而后者直接決定了小麥粉的焙烤品質(zhì)［5，13－14］。CAGC的氧化作用有利于低分子質(zhì)量谷蛋白亞基(LMW－GS)和小分子蛋白的交聯(lián)聚合，提高了面筋蛋白的聚合程度，表現(xiàn)為tanδ的下降。與CAGC相比，添加相同酶活力時(shí)(300 U/kg)GOD對(duì)G*的影響與CAGC相接近，而tanδ遠(yuǎn)低于CAGC，表明GOD的氧化作用過快，不利于GMP的聚合。

圖3 CAGC和GOD對(duì)面團(tuán)黏彈特性的影響

2．4 CAGC對(duì)面團(tuán)蠕變回復(fù)性的影響

在面團(tuán)線性黏彈區(qū)內(nèi)進(jìn)行蠕變－回復(fù)特性的研究。首先給樣品面團(tuán)一個(gè)恒定的應(yīng)力(σ(t)=σ0)，記錄面團(tuán)在100 s內(nèi)應(yīng)變?chǔ)?t)隨時(shí)間的變化，稱為蠕變階段;隨后應(yīng)力(σ(t))全部解除，記錄200 s內(nèi)已發(fā)生的應(yīng)變?chǔ)?t)隨時(shí)間的變化，稱為回復(fù)階段［15］。

圖4 CAGC和GOD對(duì)面團(tuán)蠕變－回復(fù)性的影響

如圖4所示，CAGC和GOD的添加都提高了面團(tuán)的應(yīng)變?chǔ)?t)，表明面團(tuán)的黏度η下降，在相同應(yīng)力下面團(tuán)的形變比例下降，黏彈性得到改善。對(duì)比添加300 U/kg CAGC和GOD的面團(tuán)，前者的蠕變 ε(t)略高于后者，而回復(fù)能力卻顯著優(yōu)于后者，同時(shí)隨CAGC添加量增大，面團(tuán)的回復(fù)能力大幅度提高。劉國琴等［15］和Agyare等［16］研究發(fā)現(xiàn)，面團(tuán)的回復(fù)能力和面筋的強(qiáng)度呈正相關(guān)性，面筋結(jié)構(gòu)合理、筋力強(qiáng)時(shí)，應(yīng)力消除后能較快速的回復(fù)到平衡值，同時(shí)可回復(fù)的比例提高(高聚物存在連續(xù)流變，回復(fù)時(shí)變形不可能完全回復(fù))。結(jié)合CAGC與GOD對(duì)tanδ的影響，再次證明CAGC的氧化速度更為合理，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改善，面團(tuán)的彈性和回復(fù)性變好。

2．5 CAGC對(duì)面團(tuán)顯微結(jié)構(gòu)的影響

面筋是小麥粉蛋白質(zhì)中非極性醇溶蛋白和極性較大的麥谷蛋白在吸水膨脹后形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由圖5觀察可知，空白組面筋(圖5a)的結(jié)構(gòu)均勻而規(guī)則，在保溫過程中面筋蛋白互相交聯(lián)，麥谷蛋白分子內(nèi)和分子間的—SH和—S—S—不斷發(fā)生交換形成有序網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，淀粉在面筋制備過程中被洗脫掉，使面筋蛋白呈現(xiàn)較規(guī)則的蜂窩狀結(jié)構(gòu)。添加300 U/kg GOD后(圖5b)，面筋蛋白的聚集性得到改善，網(wǎng)孔變大出現(xiàn)較大的孔洞結(jié)構(gòu)，這也直觀地證明了GOD可加強(qiáng)面筋網(wǎng)絡(luò)的形成［5］。添加300 U/kg CAGC時(shí)(圖5c)，面筋蛋白原來的蜂窩狀結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)片狀面筋網(wǎng)絡(luò)，但該網(wǎng)絡(luò)的壁膜厚度不一，孔洞的規(guī)則性也較差。CAGC的添加量提高到600 U/kg時(shí)(圖5d)，面筋網(wǎng)絡(luò)的壁膜厚度和均一性得到改善。添加1 000 U/kg CAGC面筋網(wǎng)絡(luò)更加合理(圖5e)，面筋形成大量的孔洞，壁膜薄，表面光滑且連續(xù)性優(yōu)于其他各試驗(yàn)組。這種結(jié)構(gòu)表明此時(shí)的麥谷蛋白和醇溶蛋白組合更為合理，麥谷蛋白亞基間通過二硫鍵形成有序的纖維狀大分子聚合體，醇溶蛋白填充在聚合體內(nèi)，形成規(guī)則而光滑的片狀結(jié)構(gòu)，這有利于面團(tuán)發(fā)酵時(shí)的持氣性和黏彈性，使制作的面制品多孔且松軟［4］。

圖5 CAGC和GOD對(duì)面團(tuán)顯微結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

綜合分析GOD對(duì)WG、W－SH和SDS－SH含量的影響，以及保溫后面團(tuán)黏彈性(G*)、回復(fù)性(ε(t))、聚合度(tanδ)和顯微結(jié)構(gòu)變化后可以看出，GOD在保溫前10 min內(nèi)對(duì)面團(tuán)的氧化作用最為快速，后80 min速度變慢，同時(shí)與CAGC相比最終面筋蛋白的聚合度較低，回復(fù)性較差，未形成片狀面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。分析可能的原因有4點(diǎn):首先，GOD在面團(tuán)體系內(nèi)的穩(wěn)定性較差，易發(fā)生物理化學(xué)變性［6－7］，Rakotozafy等［7］報(bào)道GOD在面團(tuán)形成20 min后失活率達(dá)35%;其次，Rakotozafy等［7］還發(fā)現(xiàn)GOD的加入降低了面團(tuán)自身含有的過氧化氫酶(POD)的穩(wěn)定性，POD的失活使GOD對(duì)—SH的氧化能力下降;再次，GOD在小麥粉加水過程中就快速發(fā)揮其活性，底物—SH含量的快速下降也不利于后期的氧化反應(yīng);最后，GOD在面團(tuán)形成過程中催化產(chǎn)生的大量H2O2，使攪拌過程中二硫鍵斷裂生成的—SH在短時(shí)間內(nèi)再次氧化交聯(lián)，而這種交聯(lián)是隨機(jī)的，不具有選擇性，谷蛋白亞基上許多敏感位點(diǎn)的—SH被小分子蛋白占據(jù)，不利于面筋蛋白空間結(jié)構(gòu)的舒展，同時(shí)敏感位點(diǎn)—SH的減少和小分子蛋白的引入都阻礙了麥谷蛋白—SH和—S—S—的交換反應(yīng)，不利于GMP的形成［2，17－18］。

經(jīng)過海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊化以后(CAGC)，酶分子被包埋在微膠囊的內(nèi)部，微膠囊壁膜可以從3個(gè)方面提高酶的穩(wěn)定性:首先，壁膜阻隔GOD與面團(tuán)的直接接觸，保護(hù)酶的天然結(jié)構(gòu)不被面團(tuán)內(nèi)蛋白酶等失活因子破壞［19］;其次，壁膜的包裹減少了GOD輔基FAD的逃逸，提高了酶的穩(wěn)定性;最后，微膠囊的多孔蛋格結(jié)構(gòu)具有一定的“剛性”，有利于GOD天然構(gòu)象的保持［19］。另外，CAGC微膠囊在面團(tuán)中有個(gè)吸水膨脹的過程，微膠囊吸水后膜上的網(wǎng)口逐漸舒張開，面團(tuán)里的GOD底物－β－D葡萄糖可以進(jìn)入微膠囊內(nèi)部被氧化生成H2O2，進(jìn)而氧化面筋蛋白里的—SH［20］。微膠囊壁膜的吸水膨脹和傳質(zhì)阻力使CAGC的氧化起始時(shí)間推后、氧化速度減慢。結(jié)果表明，添加相同酶活力的CAGC在保溫后的氧化效果比GOD更為優(yōu)良，表現(xiàn)為面筋蛋白聚合程度較大(tanδ下降)，回復(fù)能力較強(qiáng)，顯微結(jié)構(gòu)也更為合理。

綜上所述，海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊化以后的CAGC在面團(tuán)中的氧化速度減慢，作用時(shí)間增長，最終的氧化程度和面團(tuán)各項(xiàng)品質(zhì)均優(yōu)于游離GOD。

4 結(jié)論

4．1 空白組面團(tuán)WG和SDS－SH的含量隨保溫時(shí)間的延長有下降趨勢，而W－SH略有上升。CAGC和GOD均提高了面團(tuán)的WG，降低了W－SH和SDSSH含量。GOD氧化速度很快，在保溫10 min內(nèi)作用最為明顯，而CAGC的氧化速度較慢，在保溫90 min內(nèi)逐漸發(fā)揮作用。

4．2 海藻酸鈉－殼聚糖微膠囊化以后，CAGC的酶活力穩(wěn)定性提高、氧化速度減慢、作用時(shí)間延長;面團(tuán)保溫90 min后的聚合程度提高、回復(fù)能力增強(qiáng)、面筋蛋白形成壁膜薄、表面光滑且連續(xù)性好的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，面團(tuán)持氣能力和焙烤品質(zhì)提高。

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RearchontheEffectsofMicroencapsulatedGlucose OxidaseontheOxidationofDough

WangXia1ZhangTianliang1ZhouHuiming2
(WeifangMedicalCollege，MajorofFoodQualityandFoodSafety1，Weifang261053)
(FoodCollegeofJiangnanUniversity2，Wuxi214122)

Withfreeglucoseoxidase(GOD)ascomparison，thespeedanddegreeofoxidationofSHwasstudied byvariationsofwetglutenwheatflour(WG)content，solubleproteinthiol(W － SH)contentandSDSsolubleprotein thiolcontent(SDS－SH)duringincubation．Bymeansofdynamicrheologicalpropertiesofdoughandmicrostructure observation，theoxidationeffectofCAGC(wallmaterialforsodiumalginate － chitosan)ondoughwasverified．TheresultsdemonstratethattheoxidationofCAGCindoughslowedwhileenzymedurationofactionincreased．Moreover，theviscoelasticproperties(G*)，creep － recovery(ε(t))，degreeofpolymerization(tanδ)andmicroscopicstructures weresuperiortothatoffreeGOD．

microencapsulate，glucoseoxidase，wetgluten，rheological，microstructure

TQ925+．4

A

1003－0174(2012)07－0017－06

國家科技支撐計(jì)劃(2006BAD05A09)

2012－02－14

王霞，女，1982年出生，講師，糧食、油脂及植物蛋白

周惠明，男，1957年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧食、油脂及植物蛋白