董德坤 姜 瑩，2 傅旭軍 黃英運 袁鳳杰 朱丹華

利用顯色法快速篩選大豆脂肪氧化酶缺失突變體

董德坤1姜 瑩1，2傅旭軍1黃英運1袁鳳杰1朱丹華1

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所1，杭州 310021)
(深圳華大基因研究院2，深圳 518083)

以杭州國家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆資源為研究材料，利用顯色法對大豆脂肪氧化酶自然缺失突變體進行篩選。從348份種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)同時缺失大豆脂肪氧化酶Lox1和Lox2的野生大豆種質(zhì)1份ZYD04511，同時缺失大豆脂肪氧化酶Lox2和Lox3野生大豆種質(zhì)1份ZYD04452，以及缺失大豆脂肪氧化酶Lox2或其含量極低的栽培大豆種質(zhì)5份:ZDD06271、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06245和VP35。試驗結(jié)果同時表明顯色法是一種簡便快速的大豆脂肪氧化酶缺失突變體篩選方法。

大豆 脂肪氧化酶 突變體 顯色法

大豆脂肪氧化酶(Lipoxygenas，EC1．13．11．12，簡稱Lox)是一類含非血紅素鐵、不含硫的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為94～97 ku。在成熟大豆種子中約占總蛋白的1%～2%。它能催化具有順，順－1，4－戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，如亞油酸、亞麻酸等生成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物，如乙醛和茉莉酮酸脂等，這些揮發(fā)性物質(zhì)導(dǎo)致大豆及其制品產(chǎn)生豆腥味［1－3］。Theorell等［4］和Christopher等［5］先后分離純化了大豆脂肪氧化酶的3種同功酶Lox－1、Lox2和Lox3(Lox3a、Lox3b)。在形成豆制品揮發(fā)性氣味物質(zhì)和豆腥味物質(zhì)中，Lox2起主要作用，Lox1和Lox3作用相對較?。?－8］。Lox2缺失時豆腥味明顯降低，Lox2和Lox3同時缺失幾乎沒有豆腥味，當(dāng)Lox全缺失時根本不產(chǎn)生豆腥味［9］，并且Lox的缺失對大豆的性狀并無顯著影響［10］。

大豆加工過程中消除大豆脂肪氧化酶的主要手段包括高溫加熱處理、微波處理、有機溶劑萃取和水解酶處理等［11］。但是在處理的過程中大豆蛋白質(zhì)品質(zhì)會受到影響，其溶解度、黏性等特性降低或喪失;其他營養(yǎng)成分如維生素等也會受到破壞;同時加工的過程還增加了能量的消耗和生產(chǎn)成本的投入。而研究表明，使用Lox缺失大豆制作的豆制品不僅豆腥味低，而且具有較高的蛋白質(zhì)水平、VE含量和清除DPPH自由基的活性［12］。因而篩選大豆脂肪氧化酶缺失種質(zhì)用于優(yōu)良品種的選育將是一種十分有效的解決豆腥味問題的途徑。

本試驗采用顯色法對杭州國家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆種質(zhì)進行分析篩選，以期獲得大豆脂肪氧化酶缺失的優(yōu)良種質(zhì)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院杭州國家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆資源中隨機選取348份種質(zhì)用于脂肪氧化酶缺失突變體的篩選。

大豆脂肪氧化酶缺失對照分別為:脂肪氧化酶全缺失品種大青豆(缺Lox1，2，3)記為L0;Lox2和Lox3缺失品種‘五星一號’記為L1;Lox2缺失品種‘五星二號’記為L13。其中‘五星一號’和‘五星二號’由河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張孟臣研究員惠贈。

1．2 試劑與溶液配制

亞油酸、吐溫、次甲基藍、二硫蘇糖醇(DTT)、硼砂、硼酸磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tween20:上海生工生物工程技術(shù)有限公司;β－胡蘿卜素:Sigma－Aldrich公司;其他試劑均為分析純。

SLS(亞油酸鈉底物)溶液:分別稱取70．0 mg亞油酸鈉和70．0 mg Tween20，將其溶于4．0 mL水中，混合均勻后加0．55 mL 0．5 mol/L的氫氧化鈉溶液直到澄清，加蒸餾水定容至25．0 mL，抽真空處理，而后進行分裝，液氮冷凍后置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

β －CS(β －胡蘿卜素底物)溶液:稱取10．0 mg β－胡蘿卜素，加入10．0 mL丙酮，充分溶解后濾紙過濾，再加入與濾液等量的丙酮將其稀釋成50%飽和溶液，棕色瓶4℃保存。

分別配制0．2 mol/L pH=9．0的硼酸鈉緩沖液、0．2 mol/L pH=6．0的磷酸鈉緩沖液和0．2 mol/L pH=6．6的磷酸鈉緩沖液備用。

Lox1檢測溶液:分別取25．0 mL 0．2 mol/L pH=9．0的硼酸鈉緩沖液、5．0 mL 100μmol/L次甲基藍溶液、5．0 mL SLS溶液和5．0 mL蒸餾水，混勻。

Lox2檢測溶液:先將154．25 mg DTT溶于25．0 mL 0．2 mol/L pH=6．0的磷酸鈉緩沖液，而后加入5．0 mL 100μmol/L次甲基藍溶液、5．0 mL SLS溶液和5．0 mL丙酮，混勻。

Lox3檢測溶液:分別取25．0 mL 0．2 mmol/L pH=6．6的磷酸鈉緩沖液、5．0 mLβ－CS溶液、5．0 mL SLS溶液和5．0 mL蒸餾水，混勻。

1．3 樣品制備

大豆種子磨粉，過60目篩備用。每份參試品種稱取15．0 mg、30．0 mg和15．0 mg豆粉，分別置于編號為1、2、3的2．0mL干凈離心管中。在1號管中加入1．5 mL 0．2 mol/L pH=9．0的硼酸鈉緩沖液，在2號管中加入1．5 mL 0．2 mol/L pH=6．0的磷酸鈉緩沖液，在3號管中加入1．5 mL 0．2 mol/L pH=6．6的磷酸鈉緩沖液，輕搖混勻，4℃靜止提取1h，然后4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液用于下一步檢測反應(yīng)。

1．4 顯色法

參照Suda等［13］和Narvel等［14］，略有改進。

取1號管上清液0．5 mL，加入1 mL Lox1檢測溶液，混勻，反應(yīng)5 min后觀察顏色變化;取2號管上清液0．5 mL，加入1 mL Lox2檢測溶液，混勻，反應(yīng)10 min后觀察顏色變化;取3號管上清液0．5 mL，加入1 mL Lox3檢測溶液，混勻，反應(yīng)10 min后觀察顏色變化;以上檢測均以0．5 mL水代替上清液作為空白對照;顯色反應(yīng)溫度控制在25～35℃之間。

1．5 分光光度計法

參照Suda等［13］和Narvel等［14］，略有改進。

取1號管上清液0．8 mL，加入Lox1檢測溶液1．6 mL，混勻后立即放入分光光度計中，記錄A660變化，檢測時間5 min;取2號管上清液0．8 mL，加入Lox2檢測溶液1．6 mL，混勻后立即放入分光光度計中，記錄A660變化，檢測時間10 min;取3號管上清液0．8 mL，加入Lox1檢測溶液1．6 mL，混勻后立即放入分光光度計中，記錄A452變化，檢測時間5 min;以上檢測均記錄每隔10 s的動態(tài)變化數(shù)據(jù)。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

分光光度計法記錄的動態(tài)變化數(shù)據(jù)利用Origin-Pro 7．5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 顯色法篩選脂肪氧化酶缺失突變體

大豆脂肪氧化酶Lox1顯色法檢測結(jié)果顯示，當(dāng)1號管提取液與Lox1檢測溶液充分反應(yīng)后，在所有對照中(空白對照、L0、L1、L13)中，空白對照和L0(缺Lox1、Lox2、Lox3)保持不褪色(藍色)，而L1(僅含Lox1)、L13(含Lox1、Lox3)由于均含有Lox1而褪色。在被測試的348份樣品中，僅發(fā)現(xiàn)野生大豆種質(zhì)ZYD04511保持為藍色(圖1a)，表明ZYD04511可能為Lox1缺失種質(zhì)。

同樣，當(dāng)2號管提取液與Lox2檢測溶液充分反應(yīng)后，空白對照、L0保持為藍色，L1和L13溶液顏色稍淡。從348份種質(zhì)中找到2份野生大豆(ZYD04452、ZYD04511)和5份栽培大豆(VP35、ZDD06271、ZDD13834、ZDD06245和ZDD06044)顯示為藍色或淡藍色(圖1b)，表明其可能為Lox2缺失種質(zhì)或Lox2含量較低。而VP32則完全褪色，表明其可能含有Lox2。

當(dāng)3號管提取液與Lox3檢測溶液充分反應(yīng)后，空白對照和L0(脂氧酶全缺)保持為黃色，L1(缺Lox2、Lox3)稍有褪色，顯淡黃色。而L13(含Lox1、Lox3)由于含有Lox3而完全褪色。同樣在348份種質(zhì)中僅篩選到一份Lox3缺失種質(zhì)——野生大豆ZYD04452，保持為同Lox3缺失對照一樣的黃色。

圖1 部分大豆種質(zhì)脂肪氧化酶顯色反應(yīng)結(jié)果

表1 篩選獲得的脂肪氧化酶缺失種質(zhì)

2．2 分光光度計法檢測分析

圖2a反映了包括上一步顯色法篩選得到的缺失種質(zhì)和一些脂肪氧化酶不缺失種質(zhì)Lox1檢測反應(yīng)中吸光度的動態(tài)變化情況。其中，野生大豆種質(zhì)ZYD04511與Lox1缺失對照L0隨時間延長吸光度無明顯變化，說明ZYD04511可能缺失脂肪氧化酶Lox1。而其他種質(zhì)吸光度下降明顯，這些種質(zhì)根據(jù)吸光度動態(tài)變化趨勢大致可分為兩組:第一組，吸光度在很短時間內(nèi)迅速降至最低，表明Lox1催化活力較高，主要包括對照L13、VP32、VP35、ZDD13899和ZDD21255;第二組，在整個測定過程中吸光度呈緩慢下降趨勢，當(dāng)檢測時間延長至600 s時，吸光度均降至與第一組一致的水平(數(shù)據(jù)未顯示)，表明該組種質(zhì)Lox1催化活力較低。

圖2b反映了分光光度計法檢測Lox2時吸光度的動態(tài)變化。ZYD04452、ZYD04511、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06245、ZDD06271、VP35及對照L0吸光度隨時間延長無明顯變化，表明這些種質(zhì)可能缺失Lox2或其含量極低，與顯色法檢驗結(jié)果相符。對照品種L1吸光度隨時間緩慢下降，其變化幅度大于對照L0但遠遠小于吸光度明顯下降的種質(zhì);而對照L13在約250 s時吸光度有明顯下降，但600 s時仍保有較高的吸光度;這與顯色反應(yīng)時L1和L13稍有褪色結(jié)果一致，說明L1和L13種質(zhì)大豆脂肪氧化酶Lox2可能并不是完全缺失。其余參試種質(zhì)吸光度隨時間延長明顯下降，導(dǎo)致其最終褪色，說明其Lox2催化活力較高。

圖2c反映了分光光度計法檢測Lox3時吸光度的動態(tài)變化。圖中參試種質(zhì)明顯可以分為3組:第1組，ZYD04452與對照L0、吸光度隨時間變化不明顯，推測其脂肪氧化酶Lox3缺失，而L1吸光度有緩慢下降的趨勢，與顯色法L1黃色變淺的結(jié)果一致;第2組，包括ZYD04511、ZDD06245、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06271和VP35，在檢測的300 s時間內(nèi)吸光度呈緩慢下降趨勢，表明其Lox3催化活力較低;而第3組，包括對照L13、VP32、ZDD21255、ZDD13899和ZDD06140，其吸光度在50 s左右時間內(nèi)迅速降至最低后趨于平穩(wěn)，表明其Lox3催化活力較高。

圖2 分光光度法檢測大豆脂肪氧化酶時吸光度動態(tài)變化

通過顯色法和分光光度法從384份材料中篩選得到7份大豆脂肪氧化酶缺失種質(zhì)。其中2份為野生大豆種質(zhì)，3份為夏大豆類型，1份為春大豆，1份為鮮食(菜用)大豆，種質(zhì)相關(guān)信息見表1。

3 討論與結(jié)論

由于與大豆及其制品豆腥味的形成等有關(guān)，所以大豆脂肪氧化酶在育種中備受重視。依據(jù)其蛋白的物理、化學(xué)性質(zhì)以及在氧化底物過程中產(chǎn)生的特殊物質(zhì)的特性等的差異進行分析測定。測定方法除了本研究應(yīng)用的顯色法和分光光度法外還包括氧電極法、ELISA法、色譜法、SDS－PAGE、IEF－PAGE、分子標記法等［18－21］，后面幾種方法雖然各有優(yōu)點，但也存在檢測特異性和可靠性低、反應(yīng)要求高或者試驗成本高等不同的問題［21］。

顯色法是根據(jù)大豆脂肪氧化酶最適反應(yīng)pH值不同，采用相同底物、不同pH緩沖液環(huán)境分別檢測這3種脂肪氧化酶［13－14］。本研究以次甲基藍作為大豆脂肪氧化酶Lox1和Lox2檢測指示劑;由于Lox2、Lox3最適反應(yīng)pH相近，因而采用胡蘿卜素作為Lox3檢測的指示劑可以對Lox2和Lox3進行區(qū)分［13］。顯色法具有迅速靈敏、操作簡單、結(jié)果直觀等優(yōu)點，可用于大豆脂肪氧化酶缺失突變體的定性分析［22］，這些優(yōu)點也在本研究中得到進一步的驗證。

楊柳等［22］同時采用與本文相似的顯色法和薄層凝膠電泳法可對大豆脂肪氧化酶缺失體進行檢測，認為顯色法檢測Lox1和Lox2時快速、穩(wěn)定，與本文結(jié)論一致;而檢測Lox3時反應(yīng)時間(平均15 min)遠遠長于本研究(約5 min)且結(jié)果不穩(wěn)定，可能是由于樣品提取時間短(3～10 min)，導(dǎo)致Lox3提取不完全的原因。

分光光度法也是一項簡便易行的檢測脂肪氧化酶的方法之一，但是有學(xué)者認為分光光度法檢測脂肪氧化酶時要求提取物純度較高，并且不適合大豆未脫脂樣品等［13，21］。而本試驗以未脫脂大豆粉為研究對象，其檢測仍令人滿意，并與顯色法檢測結(jié)果相互驗證。說明這兩種方法均具有操作簡便、成本低等優(yōu)點。考慮到檢測時間和通量的問題，建議實際操作中采用顯色法進行大豆脂肪氧化酶缺失種質(zhì)的篩選。

本研究利用顯色法和分光光度法從348份種質(zhì)中篩選到7份大豆脂肪氧化酶缺失種質(zhì)。其中野生大豆種質(zhì)ZYD04511同時缺失脂肪氧化酶Lox1和Lox2。由于控制大豆脂肪氧化酶Lox1和Lox2的顯性基因Lx1和Lx2是緊密相斥連鎖基因［1］，Lox1和Lox2同時缺失種質(zhì)很難獲得，所以這份野生大豆種質(zhì)顯得尤為珍貴，可用于進一步的研究和利用。而篩選得到的脂肪氧化酶缺失的栽培品種，則可以根據(jù)其品種特性直接或間接用于粒用或鮮食大豆品種的改良。

［1］Eskina NAM，Grossman S，Pinsky A，et al．Biochemistry of lipoxygenase in relation to food quality［J］．Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1977，9(1):1－40

［2］Moreira MA，Tavares SR，Ramos V，et al．Hexanal production and TBA Number are reduced in soybean［Glycine max(L．)Merri．］seeds lacking lipoxygenase isozymes 2 and 3［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993，41(1):103－106

［3］Mosblech A，F(xiàn)eussner I，Heilmann I．Oxylipins:structurally diverse metabolites from fatty acid oxidation［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2009，47(6):511－517

［4］Theorell H，Holman RT，Akeson A．Crystalline lipoxidase［J］．Acta Chemica Scandinavica，1947，1(6):571－576

［5］Christoper JP，Pistorius EK，Axelrod B．Isolation of of a third isozyme of soybean lipoxygenase［J］．Biochimica et Biophysica Acta，1972，284(1):54－62

［6］Matoba T，Hidaka H，Narita H，et al．Lipoxygenase－2 isoenzyme is responsible for generation of hexanal in soybean homogenate［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1985，33，852－5

［7］徐文英，傅翠真，蘇震．大豆脂肪氧化酶研究動態(tài)［J］．植物生理學(xué)通訊，1996，32(4):308－313

［8］麻浩，官春云，何小玲，等．大豆種子脂肪氧化酶缺失基因控制豆腥味效果的研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34(4):367－372

［9］王文秀，楊春燕，張孟臣．大豆脂肪氧化酶的遺傳規(guī)律［J］．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，24(3):17－21

［10］Pfeiffer TW，Hildebrand DF，TeKrony DM．Agronomic performance of soybean lipoxygenase isolines［J］．Crop Science，1992，32:57－62

［11］張延坤．大豆腥味的產(chǎn)生及其去除方法［J］．天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，4(2):41－46

［12］Nishiba Y，Suda I．Degradation of Vitamin E，Vitamin C，and Lutein in Soybean Homogenate:A comparison of normal soybean and lipoxygenase－lacking(triple－Null)soybean［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(9):3708－3712

［13］Suda I，Hajika M，Nishiba Y，et al．Simple and rapid method for the selective detection of individual lipoxygenase isozymes in soybean seeds［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43(3):742－747

［14］Narvel JM，F(xiàn)ehr WR，Weldon LC．Analysis of soybean seed lipoxygenases［J］．Crop Science．2000，40:838－840

［15］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源所．中國野生大豆資源目錄［M］．北京，農(nóng)業(yè)出版社，1990

［16］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所．中國大豆品種資源目錄［M］．北京，農(nóng)業(yè)出版社，1982

［17］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源所．中國大豆品種資源目錄(續(xù)編一)［M］．北京，農(nóng)業(yè)出版社，1991

［18］韓粉霞，丁安林，孫君明，等．大豆脂肪氧化酶同工酶全缺失種質(zhì)的創(chuàng)新［J］．遺傳學(xué)報，2005，32(2):197－202

［19］閆彩霞，馬峙英，張彩英，等．等電聚焦凝膠電泳檢測5個大豆雜交組合中脂肪氧化酶的缺失突變［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(16):6691－6694，6697

［20］王紹東，姜妍，王浩，等．新聚丙烯酰胺凝膠電泳快速檢測大豆脂氧酶缺失方法［J］．大豆科學(xué)，2011，30(3):484－487

［19］劉淵，張孟臣，張彩英，等．大豆脂氧酶分析鑒定技術(shù)的研究進展及在育種中的應(yīng)用［J］．中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(7):101－105

［21］Feussnera I，Kühnb H，Wasternack C．Lipoxygenase－dependent degradation of storage lipids［J］．Trends in Plant Science，2001，6(6):268－273

［22］楊柳，李文濱，師臣，等．大豆脂肪氧化酶缺失體鑒定方法研究［J］．黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(4):12－14．

Rapid Screening of Soybean Lipoxygenase Lacking Mutants Using Colorimetric Assay

Dong Dekun1Jiang Ying1，2Fu Xujun1Huang Yingyun1Yuan Fengjie1Zhu Danhua1
(Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences1，Hangzhou 310021)
(Beijing Genomics Institute at Shenzhen2，Shenzhen 518083)

Lipoxygenase is one of the important anti－nutritional factors in soybean．Screening and utilization of lipoxygenase lacking mutants will greatly facilitate the improvement of soybean qualities．In this study，348 soybean germplasms from Hangzhou Sub－center of National Soybean Improvement were screened for lipoxygenase lacking mutants using colorimetric assay．One wild soybean germplasm ZYD04511 was found lacking Lox1 and Lox2;another wild soybean germplasm ZYD04452 was found lacking Lox2 and Lox3;five landraces，ZDD06271，ZDD06044，ZDD13834，ZDD06245 and VP35 showed extremely lower Lox2 content or were lacking of Lox2．Results also show that the colorimetric assay is a simple and rapid method for screening of lipoxygenase lacking mutants in soybean．

soybean，lipoxygenase，mutation，colorimetric assay

S565．1

A

1003－0174(2012)07－0110－05

浙江省公益性項目(2011C22058)

2011－10－08

董德坤，男，1978年出生，博士，大豆分子育種

朱丹華，男，1957年出生，研究員，大豆遺傳育種