郭洪亮，徐忠信

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京100020；2.北華大學附屬第一臨床醫(yī)院；3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033）

在缺血性神經(jīng)疾病的研究中，由于體內(nèi)環(huán)境較為復雜，從體外實驗模擬體內(nèi)試驗的研究愈來愈受到重視，因神經(jīng)元是不可再生細胞，神經(jīng)元的原代培養(yǎng)難度較大，最終可用于實驗的數(shù)量、純度均受到一定限制。本實驗采用PC12細胞是由大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤分離并建立起的細胞系，其在體外經(jīng)NGF刺激誘導后可向交感神經(jīng)元分化，最終導致PC12細胞在生理、生化方面都具有神經(jīng)元樣的功能，同時應用體外氧糖剝 奪 （oxygen－glucose deprivation，OGD）來模擬體內(nèi)腦缺血過程，為今后進一步探討缺血缺氧狀態(tài)下對神經(jīng)元的活力、凋亡、信號通路機制的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

大鼠PC12細胞株購自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫）。鼠神經(jīng)生長因子（NGF）（Sigma公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 PC12細胞的培養(yǎng)、傳代 將細胞懸液加入含有DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)液2－3天更換一次。當細胞匯集至80%時進行傳代接種。

1.2.2 鼠神經(jīng)生長因子（NGF）誘導PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞 PC12細胞培養(yǎng)1－2天，觀察細胞貼壁后，用含NGF終濃度為50ng／ml的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.2.3 PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的鑒定 （1）形態(tài)學觀察 細胞培養(yǎng)板每日置于倒置顯微鏡下觀察細胞胞體與突起形態(tài)、貼壁與生長情況。（2）免疫細胞化學染色鑒定 PC－12細胞分別在NGF培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時后，用NSE免疫細胞化學染色進行鑒定，顯微鏡下觀察，以在細胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽性，每張爬片隨機選取3個100×視野，計數(shù)，取均值，計算陽性細胞百分比，其中突起的長度超過胞體直徑2倍者計為陽性，每次至少計數(shù)3個孔取平均值。

1.3 PC－12細胞氧糖剝奪模型的建立與評價

1.3.1 PC－12細胞 OGD 模型的建立 PC12細胞培養(yǎng)48h后，在無菌操作臺吸凈培養(yǎng)基，用缺氧缺糖DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞3次，并用該液體孵育細胞，將培養(yǎng)板快速放入已造成缺氧環(huán)境的缺氧罐中，夾閉進氣口和出氣口；將缺氧罐放入37℃孵箱內(nèi)開始計時；根據(jù)3h、6h、9h、12h、16h、24h將細胞隨機分為6組進行評價。

1.3.2 PC－12細胞氧糖剝奪模型評價 （1）MTT法細胞存活率檢測 在OGD不同時間組及對照組每孔加入10μl MTT溶液后4h，每孔加入100μl二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值并計算細胞存活率。（2）AO／EB熒光雙染檢測細胞凋亡 細胞爬片后，將PC－12細胞依據(jù)不同的時間點行OGD處理后，取出細胞爬片，固定，滴加AO／EB混合液10－15μl，應用熒光顯微鏡記錄攝片。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PC12細胞的培養(yǎng)

初次復蘇的PC12細胞在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)，胞體圓形，直徑10－15μm，處于游離期的細胞貼壁能力較差，易聚集成團，呈半懸浮狀態(tài)；在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h后的細胞開始貼壁生長并分裂增殖，吸附期PC12細胞在培養(yǎng)基中多呈橢圓或多角形，傾向于聚集成團簇狀；培養(yǎng)約72h后，細胞進入對數(shù)生長期，此時細胞快速生長和分裂，細胞折光性強，數(shù)目明顯增多。見圖1。

圖1 處于不同生長階段的PC12細胞

2.2 NGF誘導PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞的培養(yǎng)

PC12細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細胞隨培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量無明顯增加，細胞長出的突觸增粗增長，貼壁牢固；培養(yǎng)7d后基本無法消化傳代；培養(yǎng)10d后細胞進入衰退期。

2.2.1 形態(tài)學觀察 培養(yǎng)24h，可見細胞長出較短、較細的突觸；培養(yǎng)48h，突觸數(shù)量及長度增加；培養(yǎng)72 h，突觸長度可達胞體的4－5倍，交織成網(wǎng)狀，呈典型的神經(jīng)元形態(tài)，占總數(shù)96%以上。見圖2。

圖2 NGF誘導PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元不同時間形態(tài)觀察

2.2.2 NSE免疫熒光細胞化學染色結(jié)果 NSE免疫熒光細胞化學染色結(jié)果顯示：藍色激發(fā)光下可見散在分布、呈星形并帶有較長突起的綠色熒光區(qū)域，與背景對比明顯，見圖3－A；紫色激發(fā)光下，可見復染的細胞核呈藍色熒光，見圖3－B；圖像融合后證實綠色熒光區(qū)域為PC12細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細胞，NSE免疫熒光染色呈強陽性表達，見圖3－C。

圖3 NGF誘導PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元NSE免疫熒光細胞化學染色

2.3 PC－12細胞氧糖剝奪（OGD）模型的建立與評價

2.3.1 氧糖剝奪不同時間MTT法細胞存活率檢測OGD3h細胞存活率較對照組略有降低，但無顯著統(tǒng)計學意義，隨OGD時間延長，細胞存活率逐漸下降，OGD12h后下降更為明顯，OGD24h細胞存活率降至9.08%，與對照組及OGD3h組比較差異顯著（P＜0.05）。各組細胞存活率見表1。

2.3.2 AO／EB熒光雙染檢測細胞凋亡 正常對照組細胞AO／EB染色，細胞核呈綠色熒光，見極少量的橙紅色熒光，細胞核呈較規(guī)整橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，未見明顯凋亡細胞；OGD3h、OGD6h橙紅色熒光細胞數(shù)量較對照組略有所增加；隨著OGD時程的延長，橙紅色熒光細胞數(shù)量進一步增加，可見少數(shù)核形態(tài)不規(guī)則的凋亡細胞；OGD16h橙紅色熒光的死亡細胞數(shù)量明顯增多，綠色熒光細胞數(shù)量稀少；OGD 24h細胞多數(shù)死亡，可見核碎裂、固縮呈橙紅色熒光。見圖4，表2。

表1 OGD不同時間PC12細胞存活率MTT檢測

圖4 OGD不同時間PC12細胞AO／EB熒光染色

表2 OGD不同時間AO／EB雙染細胞凋亡率檢測

3 討論

本研究于體外培養(yǎng)PC12細胞，應用NGF刺激誘導其向神經(jīng)元分化，用于神經(jīng)元氧糖剝奪模型建立。結(jié)果顯示PC12細胞經(jīng)NGF刺激轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細胞具有典型的神經(jīng)元形態(tài)，細胞不再增殖分裂，具有神經(jīng)元特性。經(jīng)特異性烯醇化酶（Neurospecific enolase，NSE）免疫細胞化學染色后，見NSE陽性神經(jīng)元胞漿及突觸呈綠色熒光，核呈藍色熒光證實為神經(jīng)元樣細胞，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

為了研究機體內(nèi)的急性缺血性腦損傷機制，我們常通過建立體外神經(jīng)細胞的OGD模型，來模擬機體缺血性腦損傷過程［1－3］。在體外建立可模擬機體急性缺血性腦損傷的神經(jīng)元OGD模型，本研究在建立PC12細胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元OGD模型的基礎(chǔ)上，在 OGD3h、6h、9h、12h、16h、24h應用 MTT法對細胞存活率進行了檢測，結(jié)果顯示隨OGD時間的延長，細胞存活率逐漸由97.23%下降至9.08%（P＜0.05），提示模型建立成功，但 MTT法是以最終溶液OD值間接計算存活率，難以反應細胞凋亡情況。因此，實驗同時應用細胞爬片法，應用AO／EB雙染對細胞原位凋亡進行了檢測。實驗結(jié)果顯示，在OGD12h之前，雖細胞凋亡率逐漸升高，但變化并不明顯；OGD12h細胞凋亡率迅速升高至較高水平，兩組實驗結(jié)果相結(jié)合說明本實驗采用的氧糖剝奪方法可明顯造成神經(jīng)細胞損傷，成功模擬體內(nèi)腦缺血過程，為研究神經(jīng)細胞缺血損傷提供有效、簡單、實用、可靠的方法和手段。

［1］Jones PA，May GR，McLuckie JA，et al.Apoptosis is not an invariable component of in vitro models of cortical cerebral ischaemia［J］.Cell Res，2004，14（3）：241.

［2］Kaushal V，Schlichter LC.Mechanisms of microglia－mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra［J］.J Neurosci，2008，28（9）：2221.

［3］Dugan LL，Kim－Han JS.Astrocyte mitochondria in in vitro models of ischemia［J］.J Bioenerg Biomembr，2004，36（4）：317.