郭龍華，陳 茶，萬澤民，何文軍，吳新忠，周 強(qiáng)，馮春顏，吳文權(quán)

（1.深圳市龍華人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518109；2.廣東省中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510120）

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）前C區(qū)定位于乙肝病毒基因組nt1814－1900，前C區(qū)是HBV基因組的高變區(qū)，前C區(qū)最常見的變異為G1896A點(diǎn)突變，使第28位密碼子TGG→TAG（終止子），翻譯提前終止，導(dǎo)致HBeAg陰轉(zhuǎn)，影響干擾素療效［1］。目前一些常用方法對前C區(qū)1896位點(diǎn)變異株與野生株的混合感染易漏檢，本研究建立的熒光定量PCR法能快速檢測乙肝病毒基因組1896位點(diǎn)變異株與野生株的混合感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本來源于本院門診和住院病人。

1.1.2 主要儀器 Roche公司LightCycler型熒光定量PCR儀、法國VL公司Bio－1D型凝膠成像儀、日本島津（Shimadzu）UV－2550型紫外可見分光光度計(jì)。

1.1.3 主要試劑 廣州達(dá)安基因公司HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（國產(chǎn)），裂解液（自配）。Taq DNA酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、DNA Marker（TaKaRa公司）、PMD18－T載體（TaKaRa公司）。

1.1.4 參照GenBank中的HBV基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5條特異性引物和1條特異性探針，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

P1：5－GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG－3′（nt 1669－1688）；

P2：5－TTG CCT GAG TGC GGT ATG GTG A－3′（nt 2071－2050）；

P3：5－TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC A－3′（nt 1825－1846）；

P4：5－TCA ATG TCC ATG CCC C－3′（nt 1911－1896）；

P5：5－TCA ATG TCC ATG CCC T－3′（nt 1911－1896）（針對突變株）；

TaqMan熒 光 探 針 ：5′－ （FAM）－CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG G－（TAMRA）－3′（nt 1891－1870）。

1.2 方法

1.2.1 收集30例 HBV DNA含量高于1×103IU／ml血清標(biāo)本（用廣州達(dá)安基因公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測）。

1.2.2 HBV DNA 的提取方法參照文獻(xiàn)［2］。

1.2.3 第一次PCR擴(kuò)增：引物P1、P2（5μmol／L）各1μl，10×緩沖液2μl，dNTP（10mmol／L）0.4 μl，Taq DNA 酶（1U／μl）0.5μl，MgCl2（25mmol／L）0.4μl，模板2μl，ddH2O 12.7μl，總體積20μl，95℃5分鐘。然后94℃0.5分鐘，53℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘共循環(huán)35次，72℃延伸5分鐘。取PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂凝膠（含EB）上電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 用試劑盒回收和純化PCR產(chǎn)物，然后克隆入PMD18－T載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，將篩選出的陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司用M13通用引物正反測序，分別選出含變異株和野生株序列重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α增菌，提取和純化質(zhì)粒，檢測A260和A280值，計(jì)算質(zhì)粒樣品濃度（μg／μl），換算出質(zhì)?？截悢?shù)濃度（IU／ml），分別稀釋成1×103IU／ml、1×104IU／ml、1×105IU／ml、1×106IU／ml作標(biāo)準(zhǔn)模板備用。

1.2.5 熒光定量PCR擴(kuò)增 每個(gè)標(biāo)本同時(shí)做2個(gè)擴(kuò)增管，一管加P3、P4（5μmol／L）各1μl，另一管加P3、P5（5μmol／L）各1μl，其余所加成份相同，10×緩沖液2μl，dNTP（10mmol／L）0.4μl，Taq DNA酶（1U／μl）0.5μl，MgCl2（25mmol／L）0.4μl，Taq－Man熒光探針 0.1μl（50μmol／L），模板 2μl，ddH2O 12.6μl，總體積20μl，94℃5分鐘。然后94℃20秒，55℃45秒，共循環(huán)40次。

1.2.6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)模板（野生株質(zhì)粒和變異株質(zhì)粒）作擴(kuò)增模板，野生株質(zhì)粒用引物P3、P4，變異株質(zhì)粒用引物P3、P5，其余擴(kuò)增條件相同，調(diào)整基線以試劑空白和陰性管不出現(xiàn)陽性為準(zhǔn)，與基線的交點(diǎn)的循環(huán)次數(shù)（Ct）值為縱坐標(biāo)，HBV DNA濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用待測標(biāo)本的Ct值求出相應(yīng)的HBV DNA含量。

1.2.7 靈敏度檢測 選取1份用廣州達(dá)安基因公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測HBV DNA含量為5×106IU／ml血清標(biāo)本，用HBV陰性血清1∶5倍連續(xù)稀釋，檢測本法靈敏度。

1.2.8 臨床標(biāo)本檢測，共檢測30例HBV DNA血清標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 第一次PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果設(shè)計(jì)產(chǎn)物長403bp，電泳結(jié)果與預(yù)期一致。

2.2 野生型質(zhì)粒去載體后序列如下

TCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCA TACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTG GGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTTGGCTTT GTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT CTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCAC CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCT ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGG TGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCATAT AAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACT CTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTC TATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGC TCTGCACCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGA ACAGTGTTCACCTCACCATACCGCACTCAG GCAA

序列中粗體字G為野生株1896位點(diǎn)。

2.3 變異型質(zhì)粒去載體后序列如下

TCAGCAATGTCACCGACCGACCTTGAGGCA TACTTCAAAGTTTGTGTGTTTAAGGACTG GGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTTGTCTTT GTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT CTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCAC CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCT ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGG TGGCTTTAGGGCATGGACATCGACCCATAT AAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACT CTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTC TATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGC TCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGA ACATTGTTCACCTCACCATACCGCACTCAG GCAA

序列中粗體字A為變異株1896位點(diǎn)。

2.4 野生型標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 見圖2。

圖2 野生型標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

2.5 變異型標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 見圖3。

圖3 變異型標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

2.6 臨床標(biāo)本檢測 本法靈敏度為1×103IU／ml，本次實(shí)驗(yàn)共檢測30個(gè)標(biāo)本，HBV DNA含量大于1×103IU／ml為陽性，有7個(gè)標(biāo)本只檢測到野生株，4個(gè)標(biāo)本只檢測到變異株，其余19個(gè)標(biāo)本都是變異株與野生株混合感染。

3 討論

HBV是不完全雙鏈環(huán)狀DNA病毒，HBV復(fù)制過程中要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏有效的堿基校對功能，故HBV基因組比一般DNA病毒易發(fā)生變異，這給疾病的預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后帶來新問題［3－4］。前C區(qū)是HBV基因組的高變區(qū)，前C區(qū)最常見的變異為G1896A，導(dǎo)致HBeAg陰轉(zhuǎn)，影響干擾素對HBV的療效。

由于干擾素對乙型肝炎病毒患者抗病毒治療療程長、存在不良反應(yīng)、患者花費(fèi)大，因而治療前需對患者進(jìn)行評估。HBeAg陰性患者，可用中藥方劑抗病毒治療［5］。干擾素治療對象主要是HBeAg陽性患者。在HBV感染者體內(nèi)，常形成以一個(gè)優(yōu)勢株為主的相關(guān)突變株病毒群，稱為準(zhǔn)種［6］（quasispecies），即變異株與野生株的混合感染。在HBeAg陽性患者體內(nèi)有些是G1896A點(diǎn)突變株和G1896野生株的混合感染，干擾素對G1896野生株有較好的療效，而對G1896A點(diǎn)突變株療效不好，對這類患者用干擾素治療體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)G1896A點(diǎn)突變株成為優(yōu)勢感染株，達(dá)不到抗病毒治療的效果。如果單純是G1896野生株感染，可直接用干擾素治療。

本法是結(jié)合3′－堿基特異性引物的熒光定量PCR法，與特異性探針雜交法、PCR－RFLP（PCR限制性片斷長度多態(tài)性分析）法、測序法等法相比具有簡單快速，且能同時(shí)檢測前C區(qū)1896位點(diǎn)變異株與野生株混合感染，有推廣應(yīng)用價(jià)值。

［1］Bayraktar Y，Koseoglu A，Temizer A，et al.Relationship between the serum alamine aminotransferase level at the end of interferon treatment and histolotic Changes in wild type and precore mutant hepatitis B virus infections［J］.J Viral Hepat，1996，3：137.

［2］郭龍華，董長垣，高 婧，等.一種從血清標(biāo)本中快速提取HBV DNA方法的建立［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，26：344.

［3］Madden CR，F(xiàn)ingeold MJ，Slagle BL.Altered DNA mutation spectrum in aflatoxin bl－treated transgenic mice that express the hepatitis B virus X protein［J］.J Virol，2002，76：1170.

［4］Charlotte LCW，Peter M，Anna LB，et al.Evaluation of a line probe assay for identification of hepatitis B virus precore Variants in serum form chronic hepatitis B carriers［J］.J Virol Methods，2008，114：97.

［5］楊宏志，王擁澤，戴 敏，等.扶正祛邪和清熱解毒方藥治療乙型肝炎病毒前C區(qū)基因變異的臨床對照研究［J］.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2003，16（13）：74.

［6］高鳳萍，左 峰.乙型肝炎病毒準(zhǔn)種的研究進(jìn)展［J］.口岸衛(wèi)生控制，2010，15（13）：52.