陳 雷，王利娜，姜慧卿

1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050000;2.河北省消化病實(shí)驗(yàn)室;3.河北省消化病研究所;4.河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

肝硬化是一種全身性疾病，HPS是肝硬化晚期嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚［1］。一氧化碳(carbon monoxide，CO)是一個(gè)潛在的血管舒張因子，而HO-1是合成內(nèi)源性CO的關(guān)鍵酶。本研究采用CBDL大鼠制備HPS動物模型，觀察HO-1在肺組織的表達(dá)，探討其在HPS發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 HO-1多克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中山生物技術(shù)公司，RTPCR擴(kuò)增系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物模型的制備及取材:成年健康雄性Sprague Dawley大鼠共18只，體質(zhì)量350～400 g，清潔級，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(DK0410-0054)。動物飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham operation，sham)、2周組和5周組，每組6只。3% 戊巴比妥鈉按0.1mL/100g體質(zhì)量腹腔麻醉，sham組大鼠沿腹白線開腹后，分離膽總管，不結(jié)扎即關(guān)腹;2周組及5周組組用4號絲線分別在近肝門處和近十二指腸端雙線結(jié)扎膽總管后，從中段剪斷膽總管，術(shù)后2周及5周處理動物，用預(yù)先充盈肝素的1 mL注射器經(jīng)腹主動脈抽血1 mL后，立即在血?dú)夥治鰞x上進(jìn)行檢測。取肝組織部分置40 g/L甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)3 μm切片，行病理及免疫組化檢測，部分于液氮中保存，以備提取mRNA和蛋白質(zhì)。

1.2.2 肝臟及肺臟組織學(xué)觀察:將甲醛固定好的肝臟、肺臟組織用石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色、MASSON染色，光鏡下觀察病理變化。

1.2.3 HO-1免疫組化染色:取肺組織以中性甲醛固定，石蠟包埋后切片常規(guī)脫蠟至水，胰酶修復(fù)抗原后依次滴加HO-1多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，以DAB顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察結(jié)果。HO-1陽性產(chǎn)物呈棕色，與背景同色為陰性。

1.2.4 Western-blot檢測肺組織 HO-1 蛋白水平:取肺組織按照1∶2(m/V)加入組織提取液，冰浴超聲勻漿，15000 r/min 4℃離心5 min，取上清液進(jìn)行乙醇沉淀。測定總蛋白量后，每孔加樣量為20 μg蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，取出膜放到T-TBS(含50 g/L脫脂奶粉)室溫封閉2 h，然后T-TBS漂洗，加入HO-1多克隆抗體，4℃孵育過夜，T-TBS漂洗，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫2 h，最后加入顯色底物，室溫暗處顯色，TE緩沖液終止反應(yīng)。

1.2.5 RT-PCR 檢測肺組織 HO-1 mRNA:以 Trizol提取肺組織總 RNA，取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體積為25 μL，41℃ 45 min;PCR:94℃預(yù)變性2 min進(jìn)入循環(huán)，HO-1引物序列:5'CTG GAA GAG GAG ATA GAG CGA A 3'，5'TCT TAG CCT CTT CTG TCA CCC T 3'。內(nèi)參照物β-actin引物序列:5'ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA G 3'，5'GTC ACC CAC ACT GTG CCCATC T 3'。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 6 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20 μL，HO-1反應(yīng)條件為94℃變性40 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并在紫外投射分析儀上對電泳條帶進(jìn)行拍照。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)各片段大小分別為1000、800、600、400、300、200 bp。應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)對電泳條帶的寬度和亮度進(jìn)行量化處理，以測量得到的HO-1/β-actin mRNA作為HO-1 mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 動脈血?dú)夥治?5周組動脈血氧(64.25±9.36)明顯降低，較 2 周組(87.23 ±10.42，P=0.00)與 sham組(92.23 ±9.12 mmHg，P=0.00)比較有顯著性差異。2周組與sham組動脈血氧均在正常范圍內(nèi)。

2.2 肝臟病理 HE(見圖1)及Masson(見圖2)染色顯示，sham組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板排列整齊。造模5周組肝臟廣泛結(jié)締組織增生，中央靜脈周圍出現(xiàn)膠原纖維沉積，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂甚至形成假小葉。

2.3 肺臟病理 各組大鼠肺臟大小均正常，無肺水腫表現(xiàn)。5周組大鼠肺臟表面可見散在淤血斑點(diǎn)，HE染色顯示各組大鼠肺臟無炎性病變，sham組肺臟毛細(xì)血管無擴(kuò)張，5周組毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，管壁內(nèi)皮細(xì)胞增生，管腔內(nèi)可見較多紅細(xì)胞滯留，肺泡容量減小(見圖3)。A:sham組無明顯細(xì)胞外基質(zhì)沉積;B:5周組大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積

圖1 肝組織病理染色(HE 100×)A:sham組正常肝小葉;B:5周組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂 圖2 肝組織病理染色(Massson 100×)圖3 肺組織病理染色(HE 100×)A:sham組肺毛細(xì)血管無擴(kuò)張;B:5周組毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，管壁內(nèi)皮細(xì)胞增生Fig 1 Histopathological changes in liver tissue(HE 100×)A:normal hepatic lobular in sham operation group;B:extensive ductular proliferation and ECM deposition after CBDL in 5 weeks group Fig 2 Histopathological changes in liver tissue(Massson trichome 100×)A:few ECM depositing in sham operation group;B:extensive connective tissue deposition after CBDL in 5 weeks group Fig 3 Histopathological changes in lung tissue(HE 100×)A:normal vascular in sham operation group;B:vascular dilatation after CBDL in 5 weeks group

2.4 肺組織HO-1免疫組織化學(xué)染色圖像 光鏡下觀察5周組大鼠肺組織中動脈和靜脈血管壁及內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮及平滑肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)HO-1表達(dá)較高，2周組表達(dá)極低，sham組基本沒有表達(dá)，對照組無陽性表達(dá)(應(yīng)用PBS代替一抗)(見圖4)。

2.5 Western-blot檢測肺組織HO-1蛋白表達(dá) 5周組HO-1蛋白表達(dá)與相應(yīng)β-actin蛋白表達(dá)比值(1.22±0.18)明顯高于 2 周組(0.12 ±0.03，P=0.00)和sham 組(0.07 ±0.02，P=0.01)，sham 組和 2 周組無明顯差異(P=0.58，見圖5)。

2.6 肺組織HO-1 mRNA的表達(dá) 擴(kuò)增得到的HO-1及內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物大小分別為438 bp、548 bp，結(jié)果顯示，5周組HO-1 mRNA 相對表達(dá)(1.84±0.17)明顯高于2 周組(0.77 ±0.22，P=0.00)和 sham 組(0.12 ±0.05，P=0.00)，2 周組明顯高于 sham 組(P=0.03，見圖6)。

3 討論

肝肺綜合征(HPS)是指肝功能不全引起肺血管擴(kuò)張、非氣體交換障礙導(dǎo)致的低氧血癥及其一系列的病理生理變化和臨床表現(xiàn)。HPS三聯(lián)癥包括:慢性肝病;室內(nèi)常氧條件下動脈血氧分壓(PaO2)下降或肺泡動脈氧分壓差(A-aDO2)增大;有肺內(nèi)血管擴(kuò)張的證據(jù)［2］。目前CBDL大鼠是唯一確定的具有人類HPS生理特征的動物模型［3］，本實(shí)驗(yàn)從上述3方面驗(yàn)證了CBDL能較好地復(fù)制HPS動物模型。肝肺綜合征發(fā)病機(jī)制尚不明確，肺血管擴(kuò)張與收縮失衡，腸內(nèi)細(xì)菌易位，腸源性內(nèi)毒素血癥、肺單核-巨噬細(xì)胞激活及血管再生可能起重要作用［4］。HPS主要的病理生理特征是動脈低氧血癥。肺部血管的擴(kuò)張是引起低氧血癥的重要原因，動脈氧分壓的改變直接反映了肺部損害的程度，對于判斷肝肺綜合征患者的病程和預(yù)后具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過病理染色證實(shí)了肺毛細(xì)血管擴(kuò)張的存在。慢性肝病特別是肝硬化門脈高壓時(shí)，肝細(xì)胞代謝功能低下，導(dǎo)致擴(kuò)血管物質(zhì)如前列腺素、血管活性腸肽、神經(jīng)激肽A、降鈣素基因相關(guān)肽及P物質(zhì)等滅活不能或產(chǎn)生過多，而縮血管物質(zhì)如酪氨酸、5-羥色胺等減少或被抑制，導(dǎo)致肺內(nèi)血管擴(kuò)張。至于哪種物質(zhì)在HPS發(fā)病中起直接作用尚不明確。

圖4 肺組織HO-1免疫組織化學(xué)染色(SP 200×)A:對照組;B:sham組;C:2周組;D:5周組Fig 4 Immunohistochemical location of HO-1 in lung tissue(SP 200×)A:control group;B:HO-1 expression in sham operation group;C:HO-1 expression in 2 weeks group lung after CBDL;D:HO-1 expression in 5 weeks group lung after CBDL

HO是血紅素降解的限速酶，可催化血紅素生成等摩爾的膽綠素、CO和鐵［5］。目前已知有3種HO同工酶:HO-1、HO-2及 HO-3。HO-1是誘導(dǎo)型，另外兩種為結(jié)構(gòu)型［6］。內(nèi)皮源性血管物質(zhì)NO在HPS形成中的作用已經(jīng)得到證實(shí)［7-8］。CO是與NO類似的介質(zhì)，近年來逐漸受到重視。CO可作為信號分子通過cGMP介導(dǎo)血管擴(kuò)張，并具有抗凋亡及抗炎作用［9-10］。內(nèi)源性NO及CO在HPS發(fā)病機(jī)制中可能獨(dú)立或協(xié)同起作用［11］。

本研究結(jié)果顯示，HO-1蛋白及mRNA的表達(dá)在5周時(shí)表達(dá)明顯增加，這與Carter等［12-13］的研究一致。2周組HO-1mRNA明顯升高，但蛋白升高差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們認(rèn)為，肝硬化對HO-1的調(diào)控是從基因水平開始的，其變化蛋白早于水平。HO-CO系統(tǒng)在肝硬化時(shí)被激活的機(jī)制尚不明確，有人報(bào)道在肝細(xì)胞壞死、纖維組織增生及假小葉形成、肝內(nèi)血液循環(huán)紊亂、門脈壓力增加時(shí)常伴有內(nèi)毒素血癥、NO合成增加、細(xì)胞因子增加，這些均可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)［14］。

HO-1在肝硬化多種組織與器官中表達(dá)均增多，HPS是肝硬化門脈高壓的肺部表現(xiàn)，HPS肺組織中HO-1的蛋白及基因水平增加體現(xiàn)了局部并發(fā)癥與原發(fā)疾病在發(fā)病機(jī)制上關(guān)聯(lián)及一致性。因此，我們推測HO-1表達(dá)增加導(dǎo)致CO增多，促進(jìn)肺微血管擴(kuò)張，可能是HPS發(fā)病機(jī)制之一。

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