包翠芬，趙 艷，宋慧娟，張尤新

（遼寧醫(yī)學(xué)院：1.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；2.基礎(chǔ)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遼寧錦州121001）

重金屬鉛具有較強(qiáng)的神經(jīng)親和性，研究表明，鉛暴露可導(dǎo)致兒童學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力改變及智力障礙。鈣－鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／Calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）信號(hào)通路在學(xué)習(xí)記憶方面發(fā)揮著重要作用，急性鉛中毒可能通過抑制該通路中CaMKⅡ活性從而影響下游信號(hào)分子，造成對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的損傷，但是其機(jī)制目前還不完全清楚［1－4］。本實(shí)驗(yàn)通過使用CaMKⅡ的激活劑、抑制劑及鉛對(duì)大鼠海馬腦片進(jìn)行處理，通過檢測(cè)其下游信號(hào)分子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)（CRE binding protein，CREB）、c－FOS的表達(dá)來探明急性染鉛對(duì)Ca2＋／CaM－CaMKⅡ 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，進(jìn)一步探討CaMKⅡ是否在大鼠海馬急性鉛中毒中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有開關(guān)作用，以闡明鉛對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠，生后30d，雌雄各半（由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（遼）2003－0011；兔抗大鼠CREB、c－FOS多克隆抗體，購于Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，購于北京中山金橋公司；醋酸鉛購于沈陽化學(xué)試劑廠；PowerPac 3000電泳儀（美國Bio－Rad公司）；Trans－blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀（美國 Bio－Rad公司）；其余試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)腦片樣品制備 取生后30d大鼠，頸脫臼處死后迅速取出大腦海馬，放入4℃的人工腦脊液（ACSF）內(nèi)，將其橫切為350μm左右的腦片，于六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中連續(xù)通入流速1mL／min的混合氣體（95%O2＋5%CO2），溫度32.5～33.5℃［5］。

1.2.2 急性染鉛樣品制備 上述樣品穩(wěn)定培養(yǎng)2h后，分為對(duì)照組（n＝5）和染鉛組（n＝35）：染鉛組加入20μmol／L醋酸鉛，分別于注入0、3、7.5、15、30、60、120min收集腦片，對(duì)照組繼續(xù)采用ACSF培養(yǎng)并與染鉛組同時(shí)收集腦片［5－6］。

1.2.3 CaMKⅡ的激活劑、抑制劑及鉛處理樣品制備 上述樣品穩(wěn)定培養(yǎng)2h后，更換培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液的種類分為4組（n＝5），（1）對(duì)照組：ACSF液；（2）激活劑組：含谷氨酸的 A CSF液（谷氨酸終濃度為5μmol／L）；（3）抑制劑組：含 K N－93的ACSF液（KN－93終濃度為100μmol／L）；（4）染鉛組：含谷氨酸及醋酸鉛的ACSF液（谷氨酸、醋酸鉛終濃度分別為5、20 μmol／L）。繼續(xù)培養(yǎng)30min后收集腦片［5］。

表1 改變CaMKⅡ活性對(duì)CREB、c－FOS活性及表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表1 改變CaMKⅡ活性對(duì)CREB、c－FOS活性及表達(dá)的影響（±s，n＝3）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

組別 p－CREB CREB p－c－FOS c－FOS對(duì)照組 0.292 5±0.003 6 0.532 5±0.025 2 0.254 6±0.026 70.407 0±0.025 5激活劑組 0.431 1±0.008 7＊ 0.514 0±0.037 8 0.395 5±0.033 2＊ 0.413 2±0.028 0抑制劑組 0.342 3±0.015 5＊ 0.558 4±0.038 6 0.104 8±0.010 6＊ 0.405 0±0.024 5染鉛組 0.235 1±0.028 6＊ 0.561 9±0.029 7 0.136 6±0.012 1＊0.411 5±0.026 4

1.2.4 免疫印跡法測(cè)定CREB、c－FOS的活性 將收集的海馬腦片樣品立即放入4℃裂解緩沖液中，靜止0.5h后超聲粉碎組織，12 000r／min，4℃離心20min，取上清液。采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白含量；按所測(cè)濃度稀釋樣品。取適量稀釋后樣品加入電泳槽進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，半干轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉后。分別加入一抗（兔抗大鼠磷酸化及非磷酸化CREB、c－FOS抗體，稀釋度為1∶1 000）4℃過夜；TBST緩沖液洗脫后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育1h，TBST緩沖液洗脫；ECL發(fā)光顯色。采用β－actin作為內(nèi)參。掃描電泳條帶，采用UVP軟件測(cè)定蛋白目的條帶的灰度值。待測(cè)蛋白質(zhì)含量＝目的條帶灰度／內(nèi)參條帶灰度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參校正后進(jìn)行方差分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 急性染鉛對(duì)大鼠海馬腦片CREB、c－FOS活性的影響免疫印跡結(jié)果顯示，采用內(nèi)參校正后，對(duì)照組CREB、c－FOS活性隨時(shí)間延長無顯著性變化；而染鉛組CREB、c－FOS活性隨時(shí)間延長呈顯著性降低趨勢(shì)，見圖1。

圖1 急性染鉛對(duì)大鼠海馬CREB、c－FOS活性的影響

圖2 Western blot測(cè)定CREB、c－FOS活性及表達(dá)

2.2 谷氨酸、KN－93、鉛對(duì)CREB、c－FOS表達(dá)的影響 谷氨酸通過活化CaMKⅡ蛋白使磷酸化CREB、c－FOS的活性分別增強(qiáng)了47%、54%，而對(duì)非磷酸化CREB、c－FOS的表達(dá)無顯著性影響；采用 KN－93抑制CaMKⅡ的活性使CREB、c－FOS活性分別降低了20%～59%，而對(duì)總量CREB的表達(dá)無顯著性影響；鉛能夠拮抗谷氨酸的作用，使谷氨酸誘導(dǎo)的CREB、c－FOS活性升高分別降低了45%～47%，而對(duì)總量CREB表達(dá)無顯著性影響，見表1、圖2。

3 討 論

環(huán)境中的鉛是影響嬰幼兒智力發(fā)育、兒童學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)毒性物質(zhì)之一，鉛中毒的作用機(jī)制研究一直是防治鉛中毒領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。目前研究表明，突觸傳遞在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮著重要的作用，而某些蛋白激酶參與了突觸傳遞過程。其中Ca2＋／CaM－CaMKⅡ是突觸后傳遞的主要通路之一。當(dāng)大腦海馬CA1區(qū)受到強(qiáng)烈刺激后，立即傳導(dǎo)至神經(jīng)使樹突的谷氨酸受體激活，進(jìn)而使與谷氨酸受體偶聯(lián)的Ca2＋通道開放，引發(fā)Ca2＋內(nèi)流及谷氨酸的釋放，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，使CaMKⅡ的Thr－286磷酸化導(dǎo)致其被激活。這種磷酸化能夠使其在細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度下降的情況下仍然保持活性，此活化過程被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)［7－8］。本研究采用體外應(yīng)用激活劑（谷氨酸）和抑制劑（KN－93）以改變培養(yǎng)腦片中CaMKⅡ活性，同時(shí)采用醋酸鉛處理腦片，以觀察其對(duì)下游信號(hào)分子活性的影響［9］。

研究表明，CREB和c－FOS是 Ca2＋／CaM－CaMKⅡ下游通路的重要因子。當(dāng)突觸活化產(chǎn)生的Ca2＋內(nèi)流激活腺苷酸環(huán)化酶，催化ATP合成cAMP，進(jìn)一步激活蛋白激酶A，使其催化亞基進(jìn)入核內(nèi)促使CREB磷酸化，形成二聚體與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，活化下游分子。而c－FOS作為第三信使，通過激活異源二聚體激活蛋白－1的結(jié)合位點(diǎn)從而完成CREB下游因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［10－13］。本研究結(jié)果顯示，大鼠海馬腦片培養(yǎng)時(shí)，激活劑組活化的CREB、c－FOS表達(dá)量與對(duì)照組比較顯著增強(qiáng)，而抑制劑組及染鉛組活化的CREB、c－FOS的表達(dá)則顯著降低，此結(jié)果提示急性鉛中毒對(duì)Ca2＋／CaM－CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響可能通過抑制CaMKⅡ的活性，影響某些蛋白激酶的激活狀態(tài)，從而降低下游信號(hào)分子CREB、c－FOS的磷酸化水平，改變CREB、c－FOS調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的能力，干擾基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙［14］。研究表明，Ca2＋／CaM－CaMKⅡ通路在鉛中毒導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損傷中發(fā)揮著重要的作用，可能作為開啟和關(guān)閉下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶點(diǎn)，對(duì)該通路的深入研究可能為揭示鉛神經(jīng)毒機(jī)制提出新的思路，為防治鉛中毒提供新的理論依據(jù)和線索。

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