蔣玉鳳 周德江 張建軍 黃 飛 史小玲

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化發(fā)生機制中起著關(guān)鍵作用[1，2]。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF） 與金屬蛋白酶組織抑制因 子 1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）都是TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的下游信號介質(zhì)[3，4]， 針對CTGF和 TIMP-1的小RNA干擾阻斷TGF-β下游信號途徑，將有望成為一種更特異和更有效的長期防治肝纖維化的手段。本研究旨在設(shè)計并構(gòu)建同時含CTGF和TIMP-1靶基因片段的雙重RNA干擾重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到大鼠肝星狀細(xì)胞，為進一步研究其對肝星狀細(xì)胞細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)分泌做準(zhǔn)備。

材料與方法

一、材料 真核表達(dá)載體psiRNA-DUO-GFPzeo、感受態(tài)大腸桿菌Lyo Comp GT115、Fast-Medi aRZeoX-Gal、Fast-MediaRZeoX-GUS、lipofectamine（ 脂質(zhì)體）2000試劑、Zeocin抗生素購自InvivoGen公司；限制性內(nèi)切酶ACC 65I、Hind III、 BbsI、MakerO'RangeR μlerTM1000bpDNALadder、MakerO'RangeRμlerTM50bp DNA Ladder與T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；少量質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；胎牛血清購自天津TBD公司；目標(biāo)OligoDNA由上海生工合成；大鼠肝HSC-T細(xì)胞株由我院中心實驗室凍存。

二、CTGF和TIMP-1短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列的設(shè)計與合成 在線查詢大鼠CTGF和TIMP-1基因序列，設(shè)計3個RNA干擾靶位，化學(xué)合成雙鏈RNA（dsRNA），各自轉(zhuǎn)染或不同組合轉(zhuǎn)染經(jīng)TGF-β1刺激活化的大鼠肝星狀細(xì)胞。篩選出對Ⅲ型膠原、透明質(zhì)酸、粘連蛋白抑制作用最強的RNA干擾候選靶位[5]（前期研究中已完成），即 CTGF：5’-GCCAGGAGAAAGACAGGUACU 和TIMP-1：5’-GCCUUCGUAAAGACCUAUAGU。 為便于克隆和鑒定，shRNA干擾序列的5'端和3'端分別引入ACC 65I和Hind III酶切位點，反義片段后接終止信號TTTTT以終止轉(zhuǎn)錄。形成ACC 65I+正義鏈+Loop+反義鏈+終止信號+Hind III的靶序列結(jié)構(gòu)模式。在真核表達(dá)質(zhì)粒psiRNA-DUO-GFPzeo（6046bp）中插入CTGFshRNA序列，再用BbsI雙酶切（質(zhì)粒中含兩個BbsI酶切位點），再插入TIMP-1shRNA序列，形成BbsI+正義鏈+Loop+反義鏈+終止信號+BbsI的靶序列結(jié)構(gòu)模式。針對CTGF和TIMP-1基因的shRNA片段序列見表1。

表1 針對大鼠CTGF和TIMP-1基因的shRNA靶序列

三、重組質(zhì)粒 psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1的構(gòu)建及鑒定用內(nèi)切酶ACC 65I和Hind III雙酶切空載質(zhì)粒psiRNA-DUO-GFPzeo，膠回收目的線性DNA；用滅菌三蒸水將shRNA片段溶解，終濃度為25μM。按以下條件完成退火：正義鏈2μl， 反義鏈 2μl，NaCl 6μl， 加三蒸水到總體積30μl，80℃ 水 浴 2min。將線性載體質(zhì)粒psiRNA-DUO-GFPzeo與退火shRNA片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，接種到含博萊霉素（ zeocin）的 Fast-MediaRZeoX-Gal固體培養(yǎng)基，做藍(lán)白篩選后提取重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1，分別用ACC 65I和Hind III雙酶切，通過電泳圖初步鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，并各取20μl重組質(zhì)粒送上海生物工程公司測序。

四、重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com（含有C TGF和TIMP-1）的構(gòu)建及鑒定 將測序確定構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF用內(nèi)切酶BbsI雙酶切（內(nèi)切質(zhì)粒中兩個不同位置的BbsI位點)，膠回收目的線性質(zhì)粒，psiRNA-GFP-CTGF與退火shRNA片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，并接種至Fast-MediaRZeo GUS固體培養(yǎng)基，將藍(lán)白篩選后提取的重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com與空載質(zhì)粒psiRNA-DUO-GFPzeo分別用內(nèi)切酶BbsI雙酶切（內(nèi)切質(zhì)粒中兩個不同位置的BbsI位點），酶切產(chǎn)物電泳顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，取20μl重組質(zhì)粒送上海生工測序鑒定。

五、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞 取肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組兩孔。分組如下：CTGF組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF）、TIMP-1組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒psiRNA-GFP-TIMP-1）、CTGF+TIMP-1組（ 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1)、Com組【轉(zhuǎn)染質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com（含有C TGF和TIMP-1）】、空質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒psiRNA-DUO-GFPzeo）與空白對照組（以等量無血清培養(yǎng)基代替質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合）。在轉(zhuǎn)染24小時和48小時后，在顯微鏡下觀察綠色熒光，并使用流式細(xì)胞儀檢測每組細(xì)胞中熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況，并以GFP表達(dá)的比率來確定轉(zhuǎn)染效率。

結(jié)果

一、重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1酶切電泳鑒定 重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1用ACC 65I和Hind III雙酶切，其產(chǎn)物經(jīng)電泳符合預(yù)期，重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1雙酶切產(chǎn)物均有一大小約5711bp（6046-335+23-23）片段（ 圖1）。

二、重組質(zhì)粒 psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1測序鑒定 經(jīng)測序顯示重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1中siRNA編碼序列與設(shè)計片段完全一致，表明載體構(gòu)建成功（ 圖 2、圖 3）。

三、psiRNA-GFP-Com酶切電泳鑒定 psiRNA-GFP-Com經(jīng)BbsI雙酶切（內(nèi)切質(zhì)粒中兩個不同位置的BbsI位點)產(chǎn)物電泳符合預(yù)期，電泳圖譜中顯示重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com雙酶切產(chǎn)物中有一大小約 3782bp（5711-1929+23-23）片段（ 圖 4）。

四、重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com測序分析 經(jīng)測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒psiRNA-GFPCom（同時含有C TGF和TIMP-1，將psiRNA-GFP-CTGF重組質(zhì)粒用BbsI雙酶切后連接上TIMP片段）中siRNA編碼序列與設(shè)計片段完全一致，表明重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com構(gòu)建成功（圖5）。

五、轉(zhuǎn)染效率測定情況 經(jīng)流式細(xì)胞儀測定，空白對照組無GFP表達(dá)，空質(zhì)粒和各組重組質(zhì)粒均有熒光蛋白表達(dá)，初步證實各重組質(zhì)粒均能轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞。同時，在24小時和48小時，空質(zhì)粒組、CTGF組、TIMP-1組與CTGF+TIMP-1組轉(zhuǎn)染效率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而它們的轉(zhuǎn)染效率均低于質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com轉(zhuǎn)染組（Com組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明Com組轉(zhuǎn)染效率最高（表2）。

表2 各組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率（%，）

表2 各組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率（%，）

與Com組比，①P＜0.05

24h 48h空白對照 無 無空質(zhì)粒 15±2① 10±2①CTGF 13±1① 9±1①TIMP-1 15±1① 8±2①CTGF+TIMP-1 14±2① 10±1①Com 20±2 15±2

討論

RNA干擾是作用于mRNA水平的基因沉默技術(shù)，細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA在Dicer酶的作用下，可形成21～23bp大小的小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA)，精確降解與 siRNA序列相同的mRNA，能特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而抑制該基因在細(xì)胞內(nèi)的翻譯，達(dá)到轉(zhuǎn)錄后水平的基因靜默[6，7]。由于siRNA表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染后可進行瞬時或穩(wěn)定的基因沉默，因此相對于化學(xué)合成的siRNA更有應(yīng)用價值和前景[8]。

CTGF是新近發(fā)現(xiàn)的一種促器官纖維化的重要細(xì)胞因子。在TGF-β的誘導(dǎo)下，由成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，反過來又介導(dǎo)TGF-β對間質(zhì)的作用，被認(rèn)為是TGF-β的下游部分生物學(xué)功能介質(zhì)，CTGF在TGF-β誘導(dǎo)下的異常高表達(dá)在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中始終起著關(guān)鍵作用[9，10]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix mealloproteiuases，MMP）在ECM降解過程中起主要作用，而其活性可特異性地被TIMP所抑制，其中TIMP-1對MMP的活性抑制作用最強[11]。TGF-β及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可誘導(dǎo)TIMP-1產(chǎn)生，從而阻斷MMPs對ECM的降解[12]。因此，TIMP-1也是TGF-β1生物學(xué)作用的下游效應(yīng)介質(zhì)。

從理論上講，通過靶向抑制CTGF和TIMP-1表達(dá)可抑制纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究篩選出對CTGF和TIMP-1具有干擾作用的RNA序列，構(gòu)建了雙重RNA干擾重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com（同時含有C TGF和TIMP-1siRNA編碼序列），并成功轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞。下一步研究擬采用針對CTGF和TIMP-1的RNA雙重干擾，力求從阻斷CTGF對ECM形成和解除TIMP-1對ECM的降解抑制（促進降解）兩方面著手，研究雙重RNA干擾重組質(zhì)粒psiRNA-GFP-Com對肝星狀細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)及ECM分泌的影響。

本次實驗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率不是太高,而質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率與堿基數(shù)目有一定的關(guān)系[13]。

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