張健珍 曾春燕 張春蘭 張烈光 趙令齋 姚細(xì)安 袁小珍

人體感染HBV后，病毒與人體的免疫細(xì)胞之間相互作用，共同影響著乙型肝炎的病程和轉(zhuǎn)歸，其中宿主免疫狀態(tài)是決定乙型肝炎臨床轉(zhuǎn)歸和治療療效的主要因素，外周血T淋巴細(xì)胞亞群是反映乙型肝炎患者免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)[1]。T淋巴細(xì)胞亞群功能紊亂是導(dǎo)致人體不能清除HBV、使病情慢性化及造成肝細(xì)胞損傷的主要原因[2]。國內(nèi)外對T淋巴細(xì)胞免疫在乙型肝炎發(fā)病中的作用報道較多，但結(jié)果不盡一致[3～5]。我們對不同HBV感染者外周血淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了檢測，以期了解慢性HBV感染的不同疾病階段T淋巴細(xì)胞亞群的變化規(guī)律及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、病例選擇 2008年1月～2011年12月我院住院的患者 230例，男 176例，女 54例，年齡10～78歲，平均年齡42.0±14.4歲。慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化的診斷符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)[6]。慢性肝衰竭的診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》的標(biāo)準(zhǔn)[7]，其中慢性乙型肝炎輕度33例、中度50例、重度32例，乙型肝炎肝硬化64例，慢性乙型肝炎肝衰竭51例。甲、丙、丁、戊型肝炎病毒和HIV標(biāo)記物為陰性，排除肝癌、自身免疫性疾病、感染等引起T細(xì)胞亞群異常的疾病。另選同期本院健康體檢的醫(yī)護(hù)人員30例作為正常對照組，男16例，女 14例，年齡 20～60歲，平均年齡 39.4±11.6歲，均無乙型肝炎及其他引起T細(xì)胞亞群變化的疾病

二、臨床檢測 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)記物（羅氏Cobase601全自動免疫分析儀和羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司）；采用實時熒光定量PCR核酸分析儀（美國ABI7300型）檢測血清 HBVDNA，檢測下限值為 500IU/ml（中山大學(xué)達(dá)安基因公司）。

三、外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測使用的三色標(biāo)記單克隆抗CD3+、CD4+和 CD8+分別與FITC、PE、PerCP熒光素結(jié)合；含beads的TrueCount管；CaliBRITEbeads；10×FACS溶 血素（美國BD公司）。FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。檢測方法：①抽取病人外周血2ml，用肝素鈉抗凝，6小時內(nèi)分析。向TrueCount管分別加入120μl抗體和50μl抗凝全血，振蕩混勻3秒，避光放置15分鐘；加1×7濃度的溶血素450μl，振蕩混勻后避光放置15分鐘，然后上機(jī)檢測；②使用CaliBRITE標(biāo)準(zhǔn)微球、FACSComp軟件調(diào)節(jié)FACSCalibur流式細(xì)胞儀PMT電壓、熒光補(bǔ)償、靈敏度，應(yīng)用MultiSet分析軟件對處理好的標(biāo)本進(jìn)行CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞絕對值計數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗，將HBVDNA水平進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，各組間計量數(shù)據(jù)以表示，組內(nèi)和組間數(shù)據(jù)的顯著性比較采用單因素方差分析和兩兩比較的q檢驗，HBVDNA水平與T淋巴細(xì)胞亞群之間關(guān)系采用雙變量Pearson相關(guān)分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異。

結(jié)果

一、不同臨床類型HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化的比較 見表1。與正常對照組和慢性乙型肝炎輕中度比，慢性乙型肝炎重度、肝炎肝硬化和慢性乙型肝炎肝衰竭患者CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞及 CD4+/CD8+細(xì)胞比值顯著下降（ P<0.05或 P<0.01）。

表1 不同臨床類型慢性HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群（）比較

表1 不同臨床類型慢性HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群（）比較

與正常對照組比，①P<0.05，②P<0.01；與慢性乙型肝炎輕、中度組比，③P<0.05，④P<0.01

例 數(shù)CD3+（ 個 /μl）CD4+（ 個 /μl）CD8+（ 個 /μl） CD4+/CD8+正常對照 301388.0±563.9 731.6±251.9 601.9±296.9 1.7±1.0肝硬化 64 982.4±509.5①③ 518.6±346.9①③ 445.6±353.9①③ 1.3±0.4①③慢性肝衰竭 51 945.5±382.5②④ 509.5±277.8②④ 426.1±198.6②③ 1.3±0.5①③慢性肝炎輕度中度重度331352.5±492.0 700.6±313.9 573.9±339.2 1.6±0.9 501303.7±540.3 689.5±293.7 568.1±243.2 1.6±0.4 321002.9±420.3③① 553.4±242.0①③ 462.7±190.9①③ 1.3±0.8①③

二、HBeAg陽性與HBeAg陰性慢性HBV感染者T淋巴細(xì)胞亞群的比較 見表2。HBeAg陽性組CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)與正常對照組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而HBeAg陰性組明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HBeAg陰性組 CD3+、CD4+和 CD8+細(xì)胞數(shù)均低于 HBeAg陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表2 HBeAg陽性與HBeAg陰性慢性HBV感染者T細(xì)胞亞群（ ）的比較

表2 HBeAg陽性與HBeAg陰性慢性HBV感染者T細(xì)胞亞群（ ）的比較

①P<0.05

例數(shù) CD3+（ 個 /μ）CD4+（ 個 /μl）CD8+（ 個 /μl） CD4+/CD8+HBeAg陽性 981291.1±559.2 689.1±298.5562.1±323.8 1.5±0.5 HBeAg陰性 1321020.1±543.1① 564.4±315.6① 454.6±249.6① 1.7±0.7

三、患者HBVDNA水平與CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值的相關(guān)性 本組230例患者 HBVDNA與 CD3+、CD4+和 CD8+細(xì) 胞 數(shù) 和CD4+/CD8+比值無相關(guān)性（ r=0.196，P=0.087；r=O.192，P=0.079；r=0.139，P=0.064；r=-0.111，P=0.093）。

討論

目前認(rèn)為宿主免疫調(diào)控紊亂是導(dǎo)致慢性肝損傷的主要原因，其中由T淋巴細(xì)胞亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫以及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控異常起著重要的作用。CD4+細(xì)胞即T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（Th細(xì)胞），在免疫應(yīng)答中被抗原激活后誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，它能促進(jìn)B細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）及其他免疫細(xì)胞的增殖和分化，具有較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)[8]。CD8+細(xì)胞包括抑制性T細(xì)胞（Ts）和殺傷性T細(xì)胞（Tc）。CD8+CTL在被細(xì)胞因子激活后，產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶，將靶細(xì)胞破壞，這是HBV感染后引起肝細(xì)胞損傷的主要原因，也是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)病毒的主要機(jī)制[9]。檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群是反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。當(dāng)T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，可導(dǎo)致免疫功能紊亂而發(fā)生持續(xù)HBV感染。

本組資料結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎重度、肝炎肝硬變、慢性肝衰竭患者外周血CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值均低于正常對照組和慢性肝炎輕中度組，提示慢性乙型肝炎病情嚴(yán)重時，細(xì)胞免疫功能減低[10]。CD4+T細(xì)胞數(shù)量下降，導(dǎo)致機(jī)體無法有效清除病毒，使感染變得遷延[11，12]。CD4+/CD8+比值是監(jiān)測人體細(xì)胞免疫功能，反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，此比值失衡可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂和一系列免疫病理改變[13]。

通過對230例HBV感染者HBV DNA水平與T細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值均與HBV DNA水平無相關(guān)性，與鐘茍華和吳健林等報道一致[14～16]。

HBV變異引起宿主免疫應(yīng)答的相應(yīng)變化，往往使感染后的病情進(jìn)展趨于復(fù)雜。所以感染HBV變異株的乙型肝炎患者，其體內(nèi)免疫應(yīng)答往往不能有效抑制病毒的復(fù)制，導(dǎo)致病情加重，病程遷延。本組資料顯示，HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)均低于HBeAg陽性患者，而兩組CD4+/CD8+比值無明顯差別，與周寶勤等報道相似[17，18]。HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV前C區(qū)發(fā)生1896nt G→A變異后，使得末端產(chǎn)生終止密碼，導(dǎo)致前C蛋白合成中斷，造成HBeAg消失，特異性的CD4+T細(xì)胞缺乏適當(dāng)?shù)目乖碳せ虿荒茏R別變異的表位，導(dǎo)致病毒得以逃避機(jī)體的免疫攻擊，不利于宿主免疫系統(tǒng)對病毒的清除。

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