方 煥 朱傳武 陳 明

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）催化亞單位可用于評估腫瘤患者病情復(fù)發(fā)與預(yù)后，但用其評估肝衰竭患者的治療療效和預(yù)后尚未見報道。目前已有研究證實肝癌患者外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）端粒酶活性可以準(zhǔn)確反映癌組織端粒酶的表達(dá)情況，檢測PBMCs端粒酶活性可以作為一種靈敏、微創(chuàng)的早期診斷肝癌的方法[1]。本研究試圖通過觀察60例肝衰竭患者入院時以及治療后28天PBMCs hTERT mRNA的動態(tài)變化，以探討hTERT mRNA在肝衰竭預(yù)后判斷中的價值。

資料與方法

一、病例來源 選擇2010年11月至2011年8月我科收治的肝衰竭患者60例，男46例，女14例，年齡20～73歲，平均年齡47.0±13.4歲。其中亞急性肝衰竭2例，慢加急性或亞急性肝衰竭33例，慢性肝衰竭25例。肝衰竭的診斷依據(jù)2006年中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會肝衰竭與人工肝學(xué)組和中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會重型肝炎與人工肝學(xué)組制定的《肝衰竭診療指南》[2]。排除合并有原發(fā)性肝癌、消化道腫瘤等惡性腫瘤患者。另選20例健康體檢者，男10例，女10例，年齡25～45歲，平均年齡31.4±7.1歲。

二、PBMCs的分離 采集空腹靜脈血5ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMCs，收集細(xì)胞并儲存于－80℃冰箱待檢。

三、hTERT mRNA水平檢測 提取細(xì)胞總RNA，實時熒光定量PCR分兩步進(jìn)行，第一步即cDNA的合成：以 Oligo（ dT）為引物，取 5μl總 RNA為模板，按照PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA；第二步即實時PCR反應(yīng)，取4μl cDNA為模板，加hTERT和β-actin引物（表1），在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴增。在熒光曲線上讀出CT值，以 β-actin為內(nèi)參照， 用 2-△△CT法計算 hTERT mRNA相對表達(dá)量?！鰿T=樣品CT均值-內(nèi)參照CT均值，△△CT=△CT-（隨機陰性對照樣品CT均值-該樣品內(nèi)參照CT均值）。

表1 引物序列及擴增長度

四、統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對計量資料先行1-K-S正態(tài)性檢驗。對符合正態(tài)分布的資料用表示，組內(nèi)均數(shù)的比較采用重復(fù)測量因素的方差分析，兩組間的比較采用獨立樣本的t檢驗。計數(shù)資料采用x2檢驗。數(shù)據(jù)相關(guān)性比較采用雙變量相關(guān)分析（Bivariate）。繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，以評價相關(guān)因素對預(yù)后的診斷價值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué).意義。

結(jié)果

一、PBMCs hTERT水平的動態(tài)變化 本組肝衰竭患者生存39例，死亡21例。以健康人PBMC hTERT mRNA水平為基數(shù)，以2-△△CT法計算患者入院時以及治療后28天內(nèi)PBMC hTERT mRNA水平的變化。結(jié)果肝衰竭生存患者在入院時hTERT mRNA水平較健康人升高2.87倍，在治療7天和14天升高4.27倍和9.23倍，治療21天和28天后升高23.35倍和30.50倍，即呈持續(xù)上升趨勢；死亡患者入院時hTERT mRNA水平較正常人升高3.01倍，在治療7天和14天后升高2.08倍和1.21倍，且在治療21天和28天后分別下降至正常人的0.28倍和0.06倍，即呈逐步下降趨勢（圖1）。

二、PBMC hTERT mRNA水平對預(yù)后判斷的價值 見表2、3和圖2。

表2 PBMC hTERT mRNA水平對預(yù)后判斷的ROC曲線下面積

表3 PBMC hTERT mRNA水平對預(yù)后判斷的價值（%）

討論

端粒是真核線性染色體的末端結(jié)構(gòu)，由端粒DNA和端粒結(jié)合，由一端高度保守的重復(fù)序列（ TTAGGG）組成，方向為 5,～3,，長度約5～15kb。 端粒長度的維持需要端粒酶的激活。自身攜帶模板是端粒酶區(qū)別于一般純蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶的主要特征。被激活的端粒酶能以端粒3，端為引物，以其RNA組分為模板，合成端粒末端的重復(fù)序列，維持端粒長度，使細(xì)胞獲得無限增殖的能力。人類端粒酶有2個亞單位組成：功能性RNA成分（human telomerase RNA，hTR）和hTERT。在這2個亞單位中，其催化亞單位對端粒酶的活性起著最為關(guān)鍵的作用。hTERT是一個單拷貝基因，定位于5P15.33，大約40kb[3]。有研究報道，人類hTERT基因與端粒酶活性具有密切的相關(guān)性。將hTERT基因轉(zhuǎn)染到端粒酶陰性的正常細(xì)胞可使其端粒酶活化，不表達(dá)端粒酶活性的細(xì)胞也不表達(dá)hTERT基因[4]。在胚胎的早期發(fā)育階段，體細(xì)胞具有端粒酶活性，但隨著胎兒的發(fā)育，所有體細(xì)胞端粒酶活性是下調(diào)的，出生后正常體細(xì)胞絕大多數(shù)均不表達(dá)[5]，而生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通常表達(dá)較高水平的端粒酶活性，說明端粒酶的表達(dá)與細(xì)胞的分化和發(fā)育有密切的關(guān)系[6]。

在肝衰竭患者，當(dāng)肝細(xì)胞開始再生時，肝細(xì)胞端粒酶的活性是否表現(xiàn)出類似于腫瘤細(xì)胞的特性，目前尚不清楚。Miura等[7]研究發(fā)現(xiàn)，急性肝衰竭患者血清hTERT mRNA水平顯著低于急性肝炎，這與急性肝衰竭的高死亡率是一致的，反映了肝細(xì)胞再生不良。Tsuruga等[8]報道，在動物研究中，用hTERT轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞脾內(nèi)注射可以顯著提高對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠的存活率，表明轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞可以作為肝細(xì)胞移植的細(xì)胞源。這些研究均提示，不論是腫瘤細(xì)胞還是肝細(xì)胞，在增殖和分化的過程中端粒酶的活性是增加的，在肝組織或外周血中檢測hTERT mRNA可以反映肝細(xì)胞的增生狀態(tài)。

Widmann等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝再生過程中肝臟非實質(zhì)細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）大量增殖，且觀察到增殖高峰分別出現(xiàn)在肝臟部分切除后的48h和96h。隨后Naughton等[10～13]發(fā)現(xiàn)增殖的Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如CSF、IL-1、IL-6和TNF-α等，這些細(xì)胞因子具有潛在激活外周血粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的能力。因此，在肝細(xì)胞再生過程中，PBMC大量增殖活化并高表達(dá)端粒酶活性。通過檢測PBMC hTERT mRNA水平可以間接反映肝細(xì)胞再生的狀況。由于肝衰竭患者病情重，直接檢測肝細(xì)胞中hTERT mRNA在實際操作中難以進(jìn)行，且由于血清中存在RNA酶，使血清hTERT mRNA的檢出率較低。本課題間接檢測肝衰竭患者PBMC中hTERT mRNA水平，以反映肝細(xì)胞的再生狀況。

在肝衰竭時，肝細(xì)胞大量破壞，肝細(xì)胞壞死后能否有及時大量的肝細(xì)胞再生決定了肝衰竭的臨床預(yù)后，殘余肝細(xì)胞再生不充分是死亡的主要原因之一。本研究在對不同轉(zhuǎn)歸肝衰竭患者治療前后外周血單個核細(xì)胞hTERT mRNA水平比較后發(fā)現(xiàn)，生存組患者治療后hTERT mRNA水平高于治療前水平，而死亡組患者治療后hTERT mRNA水平呈現(xiàn)下降趨勢，表明治療后hTERT mRNA水平升高提示肝細(xì)胞再生良好，患者預(yù)后較好；反之，則患者預(yù)后不良。

1995年美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會正式批準(zhǔn)了應(yīng)用ROC曲線圖評價實驗室檢驗項目對臨床預(yù)測準(zhǔn)確性的指導(dǎo)原則。本研究利用ROC曲線下面積評價hTERT mRNA水平對評估肝衰竭預(yù)后的價值，結(jié)果顯示，患者PBMC hTERT mRNA在預(yù)測肝衰竭預(yù)后方面有較好的診斷價值，這些還需要進(jìn)一步觀察證實。

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