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梭曼抗毒劑及其生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

2012-07-29 00:53:10閆瓏謝劍煒
關(guān)鍵詞:加合物毒劑活化劑

閆瓏,謝劍煒

梭曼抗毒劑及其生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

閆瓏,謝劍煒

神經(jīng)毒劑;梭曼;抗毒劑;檢測(cè)方法

R 99

神經(jīng)性毒劑是一類(lèi)具有速效致死性的有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物,也稱(chēng)為有機(jī)磷毒劑(OP)。美軍按化學(xué)結(jié)構(gòu)和戰(zhàn)術(shù)使用特點(diǎn)將之分為兩大類(lèi):一類(lèi)為G類(lèi)毒劑,以呼吸道吸入為主要中毒途徑,如塔崩(GA)、沙林(GB)、梭曼(GD)和環(huán)基沙林(GF)等;另一類(lèi)為V類(lèi)毒劑,以皮膚染毒吸收為主要中毒途徑,如維??怂梗╒X)和俄羅斯維??怂梗≧VX)等。梭曼因其具有難防難治的特點(diǎn),一直是國(guó)內(nèi)外防化醫(yī)學(xué)工作者研究的重點(diǎn)之一。

梭曼在常溫下為液態(tài),有弱水果味,在G類(lèi)毒劑中揮發(fā)度最低、水溶性好但水解速度很慢,遇堿時(shí)水解加速,作為化學(xué)戰(zhàn)劑具有穩(wěn)定、隱蔽、速殺等特點(diǎn)。

梭曼急性中毒可依據(jù)全血膽堿酯酶活性判斷其中毒程度。

輕度中毒時(shí),膽堿酯酶活性低于正常的70%(50%~70%),此時(shí)主要影響外周M受體,出現(xiàn)M樣癥狀,即腺體分泌增加,如汗腺分泌增加引起出汗多、唾液腺分泌增加引起流涎、淚腺分泌增多引起流淚、鼻黏膜腺體分泌增加引起流涕、支氣管腺體分泌增加引起咳嗽;平滑肌活動(dòng)增加表現(xiàn)在虹膜括約肌收縮引起瞳孔縮小、支氣管收縮引起呼吸困難、胃腸道蠕動(dòng)加快引起惡心、嘔吐、膀胱逼尿肌運(yùn)動(dòng)增加引起尿頻尿急等。

中度中毒時(shí),膽堿酯酶活性低于正常的50%(30%~50%),此時(shí)上述M樣癥狀加重,還會(huì)出現(xiàn)站立不穩(wěn)等N樣癥狀,以及反應(yīng)能力下降等中樞樣癥狀。

重度中毒時(shí),膽堿酯酶活性低于正常的30%,此時(shí)M、N樣癥狀都加重,中樞癥狀也加重,出現(xiàn)嚴(yán)重的縮瞳、流汗、流涎、肌顫、驚厥、昏迷等。

梭曼毒性強(qiáng)、作用快,必須采取有效的防護(hù)和急救措施。通常除一般的防毒面具外,還需使用皮膚防護(hù)器材。出現(xiàn)中毒癥狀時(shí)應(yīng)立即進(jìn)行自救互救,主要是注射神經(jīng)毒劑急救針、防止繼續(xù)中毒和進(jìn)行人工呼吸。

現(xiàn)就梭曼中毒的生理毒理機(jī)制、梭曼抗毒劑及梭曼中毒體內(nèi)生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法,綜述如下。

1 梭曼的中毒機(jī)制

梭曼的毒理作用機(jī)制普遍認(rèn)為是其進(jìn)入體內(nèi)后能迅速作用于膽堿能神經(jīng)的突觸和神經(jīng)末梢處的乙酰膽堿酯酶(AChE),與乙酰膽堿酯酶的結(jié)合部位和(或)催化酶解部位結(jié)合,阻止底物與酶接近且抑制酶活性,使其不能催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh),導(dǎo)致乙酰膽堿的大量蓄積,使外周和中樞的膽堿能受體過(guò)度興奮,引起神經(jīng)系統(tǒng)功能亢進(jìn),出現(xiàn)一系列中毒癥狀。由于梭曼脂溶性大,易透過(guò)血腦屏障,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用較大,急性大劑量中毒常因驚厥和呼吸中樞抑制而死亡。

神經(jīng)性毒劑進(jìn)入體內(nèi)后與AChE相互作用形成膦?;阴D憠A酯酶,因此對(duì)AChE結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)將有助于闡明有機(jī)磷類(lèi)化學(xué)毒劑的作用機(jī)制。AChE對(duì)底物的高催化效能以及其與有機(jī)磷毒劑的高反應(yīng)性能均緣于其獨(dú)特的反應(yīng)活性中心。1991年,Sussmna等首次報(bào)道了電鰩AChE催化亞基的X射線(xiàn)晶體衍射圖[1],從而確定了AChE的三維結(jié)構(gòu)。在電鰩AChE球形分子的表面有一向內(nèi)凹陷的峽谷,谷深達(dá)2 nm,幾乎占到了酶分子的一半。谷底部逐漸拓寬,酶的活性中心就位于谷底部?;钚灾行挠?個(gè)主要區(qū)域組成。(1)陰離子亞位點(diǎn),識(shí)別底物乙酰膽堿的季銨鹽基團(tuán)。(2)催化三聯(lián)體,由Ser200、Glu327及His440構(gòu)成,負(fù)責(zé)底物乙酰膽堿的水解。(3)膽堿結(jié)合位點(diǎn),Trp84、Glu199、Tyr330與Tyr442構(gòu)成了與底物的結(jié)合部位,3個(gè)芳香族氨基酸殘基中任何一個(gè)定點(diǎn)突變都能顯著降低底物與AChE的親和力以及酶的活性。在谷的入口處,有一個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)被稱(chēng)為外周陰離子位點(diǎn)(PAS),主要由一些帶負(fù)電的氨基酸Tyr70、Asp72、Tyr121和Trp279組成。不同的配基結(jié)合于PAS的位置和方式不同,但均涉及Asp72和Trp279。結(jié)合配基后的PAS,通過(guò)變構(gòu)調(diào)節(jié),可以影響酶活性中心與底物或其他配基的親和性。

乙酰膽堿或梭曼作用于AChE時(shí),都與AChE活性中心催化部位的絲氨酸羥基的氧原子共價(jià)結(jié)合。但AChE-ACh復(fù)合體中ACh酯鍵催化水解斷裂以及酶活力恢復(fù)的過(guò)程只有幾個(gè)毫秒,因此能保持突觸傳遞的靈活性。而梭曼與AChE相互作用形成的膦酰化膽堿酯酶卻很難被水解而使酶重活化[2],隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng),膦酸化膽堿酯酶失去重活化的能力,成為“老化酶”。老化是指中毒酶從可以重活化狀態(tài)到不能重活化狀態(tài),其實(shí)質(zhì)是一種自動(dòng)催化的脫烷基反應(yīng)[3]。梭曼膦?;疉ChE老化非常迅速[4],而老化酶的性質(zhì)穩(wěn)定,目前已知的所有藥物均不能使梭曼老化酶重活化[5],這是梭曼仍為目前神經(jīng)性毒劑防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)的主要原因。另一方面,被梭曼抑制的未老化酶也難被雙復(fù)磷(LüH6)、氯磷定(2PAM·Cl)、雙磷定(TMB4)等重活化劑重活化。

2 梭曼抗毒劑研究進(jìn)展

在梭曼中毒防治的各類(lèi)抗毒劑中,膽堿酯酶保護(hù)劑主要用作中毒的預(yù)防,抗膽堿能藥物可用于對(duì)癥治療和中毒的急救,而重活化劑才是治療梭曼中毒的根本措施。

2.1 季銨類(lèi)重活化劑吡啶甲醛肟類(lèi)(PAM類(lèi))化合物為第一代經(jīng)典重活化劑。1959年,Wi lson報(bào)道了吡啶醛肟季銨鹽類(lèi)化合物對(duì)膦?;疉ChE有重活化作用,并提出了幾何互補(bǔ)假說(shuō)機(jī)制[6]。此后的十年內(nèi),先后出現(xiàn)了碘磷定(2PAM·I)、甲磺磷定(P2S)等不同鹽的PAM類(lèi)化合物。其中,第一代重活化劑的代表化合物氯磷定(2PAM·Cl)具有穩(wěn)定性高、溶解度好及毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。

雙季銨吡啶醛肟類(lèi)化合物為第二代經(jīng)典重活化劑。代表化合物有雙磷定(TMB4)和雙復(fù)磷(LüH6),它們與阿托品伍用對(duì)大多數(shù)神經(jīng)性毒劑中毒的治療效果良好[7]。但是,以上藥物在治療梭曼中毒時(shí)仍然無(wú)效或效果很差。

H系列化合物和雙吡啶雙肟類(lèi)化合物為第三代經(jīng)典重活化劑[8-10],HI-6、HL?-7為其中的代表化合物。HI-6主要具有下列特點(diǎn):(1)療效顯著,對(duì)沙林、維??怂怪卸揪哂辛己玫男Ч瑢?duì)梭曼中毒也具有明顯的效果:(2)具有良好的重活化作用,在多種動(dòng)物體內(nèi)對(duì)梭曼中毒的膦?;疉ChE有顯著的重活化作用;(3)毒性低,安全范圍大。HL?-7屬于雙吡啶雙肟類(lèi)化合物。HL?-7對(duì)塔崩、沙林、梭曼和環(huán)基沙林中毒救治的有效劑量安全比大于HI-6,但水溶液或緩沖液的穩(wěn)定性比HI-6差。HL?-7對(duì)梭曼和塔崩抑制的AChE均具有較好的重活化作用,這一特點(diǎn)是以往任何重活化劑都不具備的[11]。

以上季銨類(lèi)化合物均屬于經(jīng)典重活化劑,這類(lèi)化合物主要有兩點(diǎn)缺陷:一是,難以透過(guò)血腦屏障;二是,在水溶液或緩沖液中的溶解性差。這就嚴(yán)重限制了這類(lèi)藥物的治療效果和可作為注射液使用的方便性。

2.2 叔銨類(lèi)重活化劑我國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所的科研人員經(jīng)過(guò)多年研究,發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的各種抗毒藥物具有完全不同結(jié)構(gòu)的新型叔銨類(lèi)重活化劑,開(kāi)創(chuàng)了可進(jìn)入中樞的重活化劑藥物的研究時(shí)代[12]。最初研制的藥物對(duì)梭曼的抗毒效價(jià)較低,而且藥物在水溶液中的穩(wěn)定性較差。近年來(lái),經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、篩選、合成了一系列新型的叔銨類(lèi)重活化劑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,這類(lèi)化合物不僅對(duì)塔崩、沙林和維??怂怪卸緞?dòng)物腦AChE有較好的重活化作用,而且對(duì)梭曼中毒腦AChE也有部分重活化作用。這一新型重活化劑藥物的發(fā)現(xiàn)在國(guó)際上率先開(kāi)辟了新的神經(jīng)性毒劑抗毒藥物的研究思路和方向。

3 梭曼中毒體內(nèi)生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法

神經(jīng)性毒劑的分析檢測(cè)方法依樣品來(lái)源不同而不同,其基質(zhì)主要包括水、土壤、空氣等環(huán)境樣品、食品和生物醫(yī)學(xué)樣品等。由于生物醫(yī)學(xué)樣品的分析檢測(cè)可以提供生物體接觸神經(jīng)性毒劑的暴露水平,具有較強(qiáng)溯源性,因此近年來(lái)受到世界各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注。

3.1 毒劑原型的分析檢測(cè)這類(lèi)方法的突出特點(diǎn)是可以快速、直接確定毒劑的類(lèi)型和結(jié)構(gòu)[13-14],如馮翠玲[13]采用氣相色譜法(GC)對(duì)血漿中沙林、梭曼、環(huán)基沙林、維??怂埂⒍砹_斯維??怂沟?種毒劑進(jìn)行分析檢測(cè)研究。但由于部分神經(jīng)性毒劑自身降解速率較快,或是若體內(nèi)僅存在少量毒劑原型或樣品久置后,這類(lèi)方法由于靈敏度所限,則不能滿(mǎn)足事發(fā)后毒劑的痕量檢測(cè)及溯源性檢測(cè)的要求。

3.2 毒劑代謝產(chǎn)物的分析檢測(cè)毒劑原型在體內(nèi)很不穩(wěn)定且毒劑蛋白加合物存在自然老化過(guò)程,因此容易產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的一級(jí)降解產(chǎn)物烷基甲基膦酸酯(AMPAs)和二級(jí)降解產(chǎn)物甲基膦酸(MPA),大量生物醫(yī)學(xué)樣品的分析檢測(cè)研究即是圍繞毒劑降解產(chǎn)物來(lái)建立的。梭曼的一級(jí)降解產(chǎn)物甲基膦酸頻哪酯(PMPA)即是梭曼中毒的特征性生物標(biāo)志物。見(jiàn)圖1。

圖1 梭曼水解的主要代謝產(chǎn)物

3.2.1 氣相色譜及其聯(lián)用技術(shù)尿液中毒劑降解產(chǎn)物的檢測(cè)為確證接觸神經(jīng)性毒劑提供了最簡(jiǎn)單的分析途徑。大多數(shù)代謝產(chǎn)物是小分子量的極性分子,可以在衍生化后用氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)等進(jìn)行分析。對(duì)于神經(jīng)性毒劑代謝產(chǎn)物的氣相色譜分析,常用的衍生化方法有甲基化、硅烷化和五氟芐基化[15]等。Driskel l等[16]用重氮甲烷為甲基化試劑,測(cè)定尿液中的AMPAs代謝物。衍生化反應(yīng)只需在常溫進(jìn)行10min。這是一種高通量的方法,檢測(cè)限為20 ng/mL。

最為常用的衍生化方法是將烷基膦酸酯類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化為它們的三甲基硅烷酯或者叔丁基二甲基硅烷酯。N,O-二(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)或者三甲基氯硅烷(TMCS)是常用的三甲基硅烷化衍生化試劑。國(guó)際禁止化學(xué)武器組織(OPCW)曾推薦該反應(yīng)的條件為60℃反應(yīng)30min[17]。Wang等[18]報(bào)道了人血漿中6種神經(jīng)性毒劑降解產(chǎn)物三甲基硅烷衍生物的定量檢測(cè)方法。他們首先將去除蛋白質(zhì)后的血漿中用陰離子交換柱固相萃取,再用95:5(V/V)BSTFA-TMCS衍生化,然后加入內(nèi)標(biāo)(IS)正十四烷,經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定6種衍生化產(chǎn)物。見(jiàn)圖2。選擇離子(SIM)模式下,6種降解產(chǎn)物在0.05~5.0 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。該方法對(duì)MPA的回收率可達(dá)50.2%,對(duì)PMPA的回收率可達(dá)79.7%。

圖2 人血漿中6種毒劑降解產(chǎn)物-TMCS衍生物的GC/MS 選擇離子檢測(cè)圖

當(dāng)對(duì)方法檢測(cè)限有較高的要求時(shí),可以將AMPAs衍生化為五氟芐基酯。這對(duì)于經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間、遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的中毒傷員生物樣品溯源性研究和確證化學(xué)武器施用具有重要的意義。常用的衍生化試劑為五氟芐基溴。Palit等[19]用負(fù)離子化學(xué)電離模式(NCI)對(duì)經(jīng)五氟芐基溴衍生化的AMPAs進(jìn)行GC-MS分析,檢測(cè)限可達(dá)100 pg/mL。Riches等[20]對(duì)尿液采用酸化、固相萃?。⊿PE)、五氟芐基衍生化等前處理步驟,最后進(jìn)行GC-MS分析,其中PMPA、異丙基甲基膦酸(IMPA)、異丁基甲基膦酸(i-BuMPA)和環(huán)己基甲基膦酸(CHMPA)的LOD均達(dá)到了100 pg/mL。

3.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)近十余年來(lái),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)隨著接口技術(shù)的發(fā)展已成為現(xiàn)代分析手段中必不可少的組成部分,越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)性毒劑水解產(chǎn)物的LC-MS檢測(cè)方法。Read等[21]建立了水溶液或土壤提取液中神經(jīng)性毒劑、芥子氣和失能劑水解產(chǎn)物的液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(LC-APCI-MS)和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS)定量檢測(cè)方法,檢測(cè)限均可達(dá)10~100 ng/mL。Creasy[26]用氫氧化三甲基苯胺進(jìn)行柱后衍生化,提高了LC-APCI-MS對(duì)MPA等化合物的檢測(cè)靈敏度。D'Agostino等[23]報(bào)道了LC-ESI-MS同時(shí)檢測(cè)神經(jīng)性毒劑的原型和水解產(chǎn)物的方法,并用于土壤提取液中的沙林、梭曼、IMPA和PMPA的測(cè)定。Katagi等[24]應(yīng)用液相色譜-快原子轟擊質(zhì)譜聯(lián)用(LC-FAB-MS/MS)技術(shù)分析AMPAs。但除了需要SPE提取外,此方法需要用溴苯甲酰溴對(duì)AMPAs進(jìn)行衍生化,樣品處理耗時(shí)較長(zhǎng),但檢測(cè)限達(dá)1~5 ng/mL。

3.3 膽堿酯酶加合物的檢測(cè)神經(jīng)性毒劑是具有親電性的化學(xué)物質(zhì),進(jìn)入體內(nèi)后迅速與AChE活性中心的絲氨酸羥基氧原子作用形成磷酰化酶,同時(shí)還與血漿中的丁酰膽堿酯酶(BuChE)以及白蛋白等結(jié)合,形成各種毒劑-蛋白質(zhì)(酶)加合物。如前所述,神經(jīng)毒劑與AChE的加合是其發(fā)揮毒理作用的主要反應(yīng)。中毒的BuChE在體內(nèi)半衰期為5~16天,另外BuChE在血漿中濃度達(dá)80 nmol/L,是AChE的26倍[25],是確證接觸神經(jīng)性毒劑的最佳生物標(biāo)志物之一。

Fidder等[26]分別用胰蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、鏈霉蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)梭曼-人BuChE加合物酶解,得到不同的含有膦酸基團(tuán)的肽段,再經(jīng)液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜(ESI)測(cè)定多肽序列。結(jié)果顯示,經(jīng)胃蛋白酶解得到的膦酸化九肽[FGES(MPA)AGAAS]以其酶解操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)成為理想的檢測(cè)肽段。Tsuge[27]利用普魯卡因親和層析法將BuChE-毒劑加合物從血清中分離得到,再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離純化,以胰蛋白酶酶切,產(chǎn)生的十一肽混合物GEXAGAASVSL(X代表膦酰化的絲氨酸)進(jìn)行液相色譜-電噴霧-飛行時(shí)間串級(jí)質(zhì)譜(LC-ESI-Q-TOFMS)分析,染毒BuChE的分子量較未染毒的BuChE多出120Da、106Da和162Da,分別代表和絲氨酸活性中心結(jié)合的IMPA、EMPA和PMPA。這種方法對(duì)老化的BuChE同樣有效。Elhanany[28]用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)測(cè)定不同神經(jīng)毒劑與人和電鰩AChE加合物的胰蛋白酶酶解后的肽段,確定毒劑與人AChE結(jié)合位點(diǎn)為203位的絲氨酸而與電鰩AChE結(jié)合位點(diǎn)為200的絲氨酸,并研究闡述了毒劑及有機(jī)磷農(nóng)藥與AChE的作用機(jī)制。

氟離子置換法的原理是神經(jīng)性毒劑在體內(nèi)和AChE及BuChE的絲氨酸羥基結(jié)合后生成了膦?;哪憠A酯酶,與孵育后,神經(jīng)性毒劑的膦酸基部分可以從膽堿酯酶中釋放出來(lái),再生生成有機(jī)氟膦酸酯。此方法樣品制備簡(jiǎn)單,可以追溯染毒毒劑的結(jié)構(gòu)原型,同時(shí)也可以滿(mǎn)足微量中毒檢測(cè)和溯源性檢測(cè)的要求。白海紅等[29]采用了氟離子重活化-氣相色譜質(zhì)譜方法檢測(cè)染毒人血清中的神經(jīng)性毒劑沙林。向C18柱凈化后的染毒血清中加入終濃度為0.2mol/L的氟化鉀,于37℃、pH 5.5重活化2min,反應(yīng)混合物經(jīng)C18柱及二氯甲烷洗脫后得到GB毒劑原型,濃縮洗脫液進(jìn)行GC-MS分析,檢出限為4%的酶活性抑制率。氟離子置換法亦被擴(kuò)展到5種神經(jīng)性毒劑(塔崩、沙林、環(huán)基沙林、梭曼和維??怂梗┑姆治觯啥繖z測(cè)到血漿樣品中僅0.01%的Bu-ChE活性被抑制的情況[25]。值得說(shuō)明的是,梭曼與AChE加合后難以重活化,但梭曼與其他蛋白質(zhì)的加合物可被氟離子置換,因此可以通過(guò)此法測(cè)定梭曼中毒樣品。

3.4 白蛋白加合物近年來(lái),神經(jīng)性毒劑與白蛋白(411位的酪氨酸)的加合物亦受到重視。雖然血清白蛋白和毒劑的結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)小于膽堿酯酶,但是在血清中,白蛋白是高豐度蛋白,其濃度是膽堿酯酶的1000倍之多,同時(shí)白蛋白-毒劑加合物目前未發(fā)現(xiàn)存在老化現(xiàn)象[30],發(fā)展白蛋白-毒劑加合物為生物標(biāo)志物的毒劑檢測(cè)方法對(duì)于確證毒劑接觸,實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景。由于該方法檢測(cè)的對(duì)象同樣是生物大分子,所以多數(shù)研究人員選擇90年代以來(lái)飛速發(fā)展的生物質(zhì)譜如電噴霧電離質(zhì)譜(ESI/MS)、MALDI-TOF/MS等儀器作為研究的工具。

Wi l l iams等[30]將神經(jīng)毒劑與血漿孵育后,用鏈霉蛋白酶酶解血漿樣品中的白蛋白(pH 9.4),再經(jīng)C8固相萃取柱提取富集梭曼-酪氨酸加合物,最后用LC-MS/MS(ESI)進(jìn)行樣品分析,該方法的線(xiàn)性范圍為0.5~250 ng/mL。Li等[31]用胃蛋白酶酶解孵育后的血漿樣品,經(jīng)MALDI-TOF/MS分析,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒劑結(jié)合的兩條特異肽段(VRYTKKVPQVSTPTL和LVRYTKKVPQVSTPTL)。當(dāng)用胰蛋白酶酶解時(shí),可得到與毒劑結(jié)合的三肽YTK。Read等[32]通過(guò)染毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不同于梭曼-BuChE加合物,梭曼-白蛋白加合物不會(huì)發(fā)生老化,且不受重活化藥物HI-6的影響。

Bao等[33]建立了血漿中神經(jīng)性毒劑-白蛋白加合物的液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測(cè)方法。樣品處理方法為親和柱提取血漿中的白蛋白,再經(jīng)鏈霉蛋白酶酶解消化,最后通過(guò)固相萃取凈化、富集目標(biāo)物。該方法對(duì)于梭曼加合物的線(xiàn)性范圍可達(dá)0.5~1000 ng/mL。將此方法應(yīng)用于沙林、梭曼、維埃克斯3種神經(jīng)性毒劑染毒大鼠,測(cè)定出不同染毒劑量下動(dòng)物血液中酪氨酸加合物的濃度。

隨著儀器分析技術(shù)方法的快速發(fā)展,色譜(GC、LC)及其質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于具有高選擇性、高靈敏度和可進(jìn)行化合物確證等優(yōu)點(diǎn)已成為OPCW核查締約國(guó)是否履約的有力工具。通常由于中毒的生物樣品都是在幾天或是數(shù)周之后才能得到,且大多數(shù)神經(jīng)性毒劑的半數(shù)致死量低,因此建立的溯源性檢測(cè)方法必須具有較高靈敏度和專(zhuān)屬性。近年來(lái),神經(jīng)性毒劑與大分子加合物以其在靈敏度、溯源性、專(zhuān)屬性等方面的優(yōu)勢(shì)已成為生物標(biāo)志物的研究熱點(diǎn),并且建立針對(duì)梭曼及其代謝產(chǎn)物以及梭曼中毒酶、老化酶的定量分析方法,也將為梭曼中毒后體內(nèi)代謝過(guò)程及組織分布等毒理機(jī)制的研究,探索重活化劑作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的解毒藥物提供重要的研究手段。

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全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”重大項(xiàng)目(AWS11C004-1)

100850北京,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院六所(閆瓏,謝劍煒)

謝劍煒,E-mai l:xiejw@bmi.ac.cn

2012-08-28)

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