王靜雯，王德文，李楊，左紅艷，徐新萍，王少霞，郭曉明，彭瑞云

大鼠擠壓傷所致急性腎損傷的病理生理變化

王靜雯，王德文，李楊，左紅艷，徐新萍，王少霞，郭曉明，彭瑞云

目的：分析大鼠擠壓傷所致急性腎損傷的病理生理改變。方法：雄性Wistar大鼠48只，體重200～230 g，隨機分為對照組（12只）和擠壓傷組（36只），鉗夾大鼠雙后肢近端建立大鼠擠壓傷模型，于第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天取血檢測尿素氮（BUN）、肌酐（Cr），觀察腎臟組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變，免疫組織化學(xué)方法檢測腎臟c-Fos表達(dá)。結(jié)果：擠壓傷大鼠BUN水平第1天、第3天、第5天高于對照組，Cr于第1天、第3天、第5天升高具有顯著性差異（P＜0.01），第7天漸恢復(fù)，至第11天均趨于正常；腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞于第3天、第5天出現(xiàn)變性、凋亡，第7天后漸恢復(fù)；c-Fos在第5天可見明顯的陽性表達(dá)細(xì)胞。結(jié)論：擠壓傷引起大鼠腎臟功能和形態(tài)學(xué)改變，并誘導(dǎo)腎臟c-Fos表達(dá)。

擠壓傷；急性腎損傷；形態(tài)學(xué)；c-Fos

R 363.2

嚴(yán)重地震等自然災(zāi)害、礦難等意外事故可引起建筑物倒塌和人員掩埋，常常發(fā)生擠壓傷[1]。擠壓傷所致急性腎損傷是擠壓傷傷員死亡的重要原因之一，其治療措施尚有待進(jìn)一步探索和改善。由于近年重大地震等時有發(fā)生，擠壓傷所致急性腎損傷的研究備受矚目。本實驗擬系統(tǒng)觀察擠壓傷后大鼠腎功能、腎臟組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)改變，并動態(tài)檢測腎臟c-Fos表達(dá)，探討其變化與腎臟功能和病理損傷的關(guān)系，旨在為擠壓傷所致急性腎損傷的研究和防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料清潔級雄性Wistar大鼠48只，體重200～230 g；兔抗c-Fos抗體（美國Santa Cruz公司）；聚合物輔助劑（北京中杉金橋生物公司）；辣根酶標(biāo)記抗兔IgG多聚體（北京中杉金橋生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立實驗大鼠隨機分為擠壓傷組（36只）和對照組（12只），擠壓傷組活殺時間點于第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天，每個時間點6只。擠壓傷模型建立采用5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后鉗夾大鼠雙后肢近端的方法。對照組不予任何處理。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測實驗大鼠解剖時下腔靜脈取血，全自動生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。

1.2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察3.1%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定2 h，梯度乙醇和丙酮脫水，Epon812包埋，制作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，Phi lip-CM120型透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.4 免疫組織化學(xué)石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，3%H202孵育10min去除內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后，c-Fos一抗（1:50）4℃過夜，聚合物輔助劑37℃孵育30min，辣根酶標(biāo)記抗兔IgG多聚體孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片隨機選取3個視野，計數(shù)細(xì)胞核呈棕黃色陽性表達(dá)細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)采用t檢驗，以±s表示，P＜0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 BUN和Cr水平與對照組比較，擠壓傷后第1天、第3天、第5天血清BUN升高，但差異不顯著，第7天后趨于正常（圖1，A）；擠壓傷第1天、第5天血清Cr水平與對照組明顯升高（P＜0.01），第7天后趨向正常，與對照組無明顯差異（圖1，B）。見圖1。

2.2 腎臟組織學(xué)改變擠壓傷第1天大鼠腎臟未見明顯組織學(xué)改變，于擠壓傷第3天腎皮質(zhì)近曲和遠(yuǎn)曲腎小管上皮細(xì)胞濁腫，并可見胞漿空泡（圖2，A、B）；第5天腎皮質(zhì)和髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞除上述改變外，出現(xiàn)明顯細(xì)胞腫脹、胞漿疏松淺染等水樣變性表現(xiàn)和核固縮濃染，并可見于各段腎小管，尤以皮質(zhì)內(nèi)側(cè)（內(nèi)皮質(zhì)）和髓質(zhì)外側(cè)為嚴(yán)重（圖2，C、D）；第7天后漸恢復(fù)，到第11天未見結(jié)構(gòu)明顯異常。見圖2。

2.3 腎臟超微結(jié)構(gòu)改變超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，于擠壓傷第3天皮質(zhì)和髓質(zhì)各段腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹，局部囊泡化，細(xì)胞核核形不規(guī)則，染色質(zhì)凝聚、邊集，重者呈細(xì)胞凋亡改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞也見類似變化。見圖3。

圖1 擠壓傷對大鼠BUN和血清Cr水平的影響

圖2 擠壓傷后大鼠腎臟組織學(xué)改變（×200）

圖3 擠壓傷第3天大鼠腎臟皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

2.4 腎臟c-Fos表達(dá)大鼠腎臟c-Fos免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組和擠壓傷組第1天、第3天、第7天、第9天、第11天均僅見腎小管上皮個別細(xì)胞胞漿淺染，未見明確的細(xì)胞核陽性細(xì)胞（未示），擠壓傷組第5天皮髓質(zhì)各段腎小管均可見c-Fos細(xì)胞核表達(dá)陽性細(xì)胞，其中皮質(zhì)c-Fos陽性細(xì)胞百分比（7.00±1.00）%，髓質(zhì)陽性細(xì)胞百分比（7.67± 0.58）%。見圖4。

圖4 擠壓傷誘導(dǎo)大鼠腎臟c-Fos表達(dá)（×400）

3 討論

四肢或軀干肌肉豐富部位長時間受到擠壓可造成肌肉壞死溶解，擠壓傷后引起的全身改變是多方面的，但其中最主要在于對腎臟產(chǎn)生的損害[2-3]。有研究表明，擠壓傷后BUN和血清Cr升高，腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察可見腎小管上皮細(xì)胞壞死[4]，但迄今對持續(xù)性擠壓傷所致急性腎損傷中腎功能和形態(tài)學(xué)的動態(tài)變化規(guī)律和特點尚未見系統(tǒng)深入的研究報道。對擠壓傷所致急性腎損傷機制的研究表明，自由基、NO在擠壓傷所致急性腎損傷中起重要作用[5]，發(fā)生擠壓傷后大鼠腎臟炎性因子TNF-α、ICAM-1表達(dá)升高，腎小管上皮細(xì)胞Fas、FasL、Bcl-2等凋亡蛋白表達(dá)增加，擠壓傷后腎組織發(fā)生低氧，這可能是擠壓傷后發(fā)生急性腎損傷的重要機制之一[6]，然而，擠壓傷所致急性腎損傷的機制至今尚未完全明確，有關(guān)c-Fos在其中作用還未見文獻(xiàn)報道。

目前國內(nèi)外研究擠壓傷多采用甘油肌肉注射或重物壓迫的方法[7-9]，本實驗室首次應(yīng)用鉗夾方法成功建立了擠壓傷模型，與目前國內(nèi)外相關(guān)研究中應(yīng)用較多的甘油肌肉注射方法相比，更為接近臨床實際；與應(yīng)用重物壓迫建立的模型方法相比，則具有簡單易行，并可進(jìn)行持續(xù)擠壓所致?lián)p傷效應(yīng)研究的優(yōu)點。本實驗系統(tǒng)觀察了BUN和Cr的動態(tài)變化規(guī)律，在擠壓傷第1天、第3天、第5天中，BUN水平顯示出升高的趨勢，擠壓傷第1天、第5天血清Cr水平顯著高于對照組，表明本實驗中擠壓傷導(dǎo)致了急性腎功能損傷。擠壓傷后第7天血清BUN和Cr漸恢復(fù)，到第11天達(dá)正常水平，可能與鉗夾肢體于第7天到第11天已干枯、脫落，橫紋肌壞死溶解減少，同時，腎臟病理損傷明顯減輕，甚至接近消失，腎功能進(jìn)入恢復(fù)階段有關(guān)。

本實驗系統(tǒng)揭示了擠壓傷后大鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變的動態(tài)變化規(guī)律和特點。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，于擠壓傷第3天腎皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)胞漿空泡，第5天腎皮髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、胞漿疏松淺染等水樣變性、核固縮濃染改變，第7天進(jìn)入恢復(fù)階段。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，擠壓傷第3天腎小管上皮細(xì)胞線粒體擴(kuò)張，局部囊泡化，細(xì)胞核核形不規(guī)則，染色質(zhì)凝聚邊集，并發(fā)生細(xì)胞凋亡。以上研究結(jié)果表明，擠壓傷后腎小管損傷最早見于皮質(zhì)，遠(yuǎn)曲和近曲小管均可發(fā)生損傷，隨擠壓時間延長，皮髓質(zhì)各段腎小管均可出現(xiàn)損傷。本擠壓傷模型所致急性腎功能和結(jié)構(gòu)損傷起病具有快速性、病程呈現(xiàn)階段性（早期第1天、高峰期第5天、恢復(fù)期第7天后）和病變累及部位的廣泛性（腎皮質(zhì)和髓質(zhì)、各級腎小管均受累及）。

c-Fos是即早反應(yīng)基因之一，屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族，與其他分子形成異源聚合物，調(diào)控多種生理和病理過程[10-11]。既往研究表明，缺血再灌注、一些毒物和藥物引起的損傷等可誘導(dǎo)腎臟c-Fos高表達(dá)，其高表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]，但c-Fos在擠壓傷所致急性腎損傷中的病理生理意義尚未見有關(guān)文獻(xiàn)報道。本實驗首次動態(tài)觀測了擠壓傷后不同時間大鼠腎臟c-Fos表達(dá)變化，并探討了其變化與腎臟功能和病理損傷的關(guān)系，結(jié)果顯示，擠壓傷僅于第5天出現(xiàn)c-Fos細(xì)胞核陽性細(xì)胞，且c-Fos陽性表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)時間與形態(tài)學(xué)改變具有明顯的同步性，提示c-Fos可能參與擠壓傷后腎臟病理生理改變。其作用有待進(jìn)一步深入研究。

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國家科技部709項目（No.2006FK130006）

100850北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所（王靜雯，王德文，李楊，左紅艷，徐新萍，王少霞，郭曉明，彭瑞云）

王德文，E-mai l：wangdewen1938@yahoo.com.cn

2012-10-15）