楊 向，張華茂(都江堰市醫(yī)療中心外二科，四川都江堰 611830)

胰腺癌居腫瘤死因第4位，確診時往往已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，中位生存期不到6個月，是預(yù)后最差的腫瘤之一［1］。胰腺癌診斷明確時，超過80%的患者已屬中晚期，失去了手術(shù)的機會。即使手術(shù)切除者，總的5年生存率也僅為l8%，局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移比例仍居高不下［2］。對于無法手術(shù)切除與術(shù)后復(fù)發(fā)以及遠處轉(zhuǎn)移的患者，化療成為腫瘤治療的有效方法，有利于延長患者生存時間、改善患者生活質(zhì)量，因此尋找有效的化療藥及提高療效成為胰腺癌治療的重要研究內(nèi)容。本研究觀察中藥復(fù)方苦參注射液對惡性腫瘤細胞是否有直接抑制作用及其聯(lián)合化療對于惡性腫瘤的療效，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌細胞SW1990株購于中科院上海細胞庫，MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自 Sigma公司，優(yōu)級胎牛血清購自Invitrogen公司，二甲亞砜及MTT購于南京探求生物技術(shù)公司，復(fù)方苦參注射液由山西振東制藥股份有限公司提供，其余所用試劑均為國產(chǎn)分析純市售商品，化療藥選擇氟尿嘧啶(5-FU)，按Limburg和 Heckman公式:Cmax=D(mg)/5 000×2×103 μg·mL-1(血漿)，計算并配制出藥物的工作濃度，5-FU 濃度為 1 000 μg·mL-1。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰腺癌細胞株培養(yǎng):胰腺癌SW1990細胞株復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U·mL-1的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長后每2 d換液1次，生長密度達90%時用0.25 g·L-1的胰酶消化傳代。

1.2.2 實驗分組:實驗設(shè)空白組(加培養(yǎng)液200 μL)、對照組(單細胞懸液100 μL+培養(yǎng)液100 μL)、實驗組(單細胞懸液100 μL+各種處理藥物溶液100 μL)。實驗組又分苦參堿聯(lián)

合化療組、單純化療組。

1.2.3 胰腺癌細胞生長抑制率測定:采用MTT法，棄去培養(yǎng)基后，用PBS液洗滌2次，加入0.25%胰酶和0.02%EDTA，消化5 min后吸棄，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)，吹散、混勻、計數(shù)，以3×105個/mL密度接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中(5%CO2、95%空氣、37℃)培養(yǎng)，每孔加入單細胞懸液 100 μL、藥物 100 μL，分別培養(yǎng) 24、48、72 h 后，每孔加入40 μL MTT液(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液。每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用酶標(biāo)分析儀在490 nm下測定各孔吸光度。按公式:細胞抑制率(IR)=1-(藥物組吸光值/對照組吸光值)×100%，計算各組細胞抑制率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 苦參堿直接對人胰腺癌細胞的增殖抑制率

5%、10%、20%、30%濃度的苦參注射液在體外分別作用于人胰腺癌細胞72 h后，重復(fù)測試4次，測得其對人胰腺癌細胞的增殖抑制率，結(jié)果顯示其抑制作用和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且與藥物溶度呈正相關(guān)性，見表1。

2.2 單純化療及聯(lián)用苦參堿對人胰腺癌細胞的抑制作用

單純化療組使用的1倍PPC(1PPC)的5-FU，聯(lián)用組應(yīng)用1PPC的5-FU加5%、10%、20%、30%濃度的苦參注射液，重復(fù)測試4次，測定其抑制率，2組相比、不同時間相比有明顯差異，見表2(不同藥物濃度組與5%濃度組比較，P＜0.05)。

表1 苦參堿直接對人胰腺癌細胞的增殖抑制率(%)Tab 1 In-vitro inhibition ratios(%)of human pancreas cancer cell line SW1990 treated with Compound Matrine Injections

3 討論

目前，大部分胰腺癌患者就診時已屬晚期，手術(shù)切除率低［3］，即使能夠手術(shù)切除的病例，其術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高。胰腺癌的這種低切除率和高復(fù)發(fā)率決定了化療在其綜合治療中仍占十分重要的地位。遺憾的是，目前胰腺癌的化療效果仍不十分理想，胰腺癌的天然性和獲得性耐藥是化療失敗的主要原因［4-6］。

表2 單純化療及聯(lián)用苦參堿對人胰腺癌細胞的增殖抑制率(%)Tab 2 In-vitro inhibition ratios(%)of human pancreas cancer cell line SW1990 treated with chemotherapy alone or in combination with Compound Matrine Injections

鑒于胰腺癌化療效果差，尋找有效的化療藥、提高化療效果成為胰腺癌治療的重要研究內(nèi)容?？茖W(xué)試驗和臨床實踐均證明中藥具有較好的抗腫瘤作用，利用其與化療聯(lián)合應(yīng)用，以提高化療效果，是有價值的研究方向［7］。復(fù)方苦參注射液是以苦參、白土茯苓為原料，經(jīng)科學(xué)提煉而制成的中藥注射劑，含苦參堿＞18 mg·mL-1。苦參清熱燥濕，白土茯苓清熱解毒。實驗研究證明，苦參堿、氧化苦參堿、脫氫苦參堿等不僅對腫瘤細胞有直接殺傷作用，而且可誘導(dǎo)某些腫瘤細胞向正常細胞分化和促進凋亡［8］。因此，研究苦參堿和5-FU的聯(lián)合化療并與單純化療作對照，可有效觀察其對化療的協(xié)同療效，對臨床的抗腫瘤治療有指導(dǎo)意義。

本實驗觀察了不同溶度的苦參注射液在體外對人胰腺癌細胞SW1990細胞生長的抑制作用，結(jié)果表明，不同濃度的苦參注射液對人胰腺癌細胞SW1990均有體外直接抑制作用，且抑制程度和藥物溶度呈正相關(guān)，不同濃度藥物作用相比差異顯著(P＜0.05)。本研究還觀察了體外化療藥與不同濃度的苦參堿聯(lián)合化療對體外人胰腺癌細胞SW1990細胞生長的影響，結(jié)果表明，苦參堿和5-FU的聯(lián)合化療的抑制率明顯高于單用化療藥，提示苦參堿和化療藥之間有協(xié)同作用。本文研究結(jié)果為臨床應(yīng)用苦參注射液治療胰腺癌提供了實驗室依據(jù)，該藥除具有體外直接抑制腫瘤細胞增殖、增強5-FU的抗腫瘤作用外，同時能增強機體的免疫功能狀態(tài)特別是細胞免疫功能，間接發(fā)揮對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用。從這個意義上講，復(fù)方苦參注射液可作為中醫(yī)藥中的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，成為中晚期惡性腫瘤的有效治療手段之一。

［1］Takhar AS，Palaniappan P，Dhingsa R，et al.Recent developments in diagnosis of pancreatic cancer［J］.BMJ，2004，329(7467):668.

［2］Cameron JL，Riall TS，Coleman J，et al.One thousand consecutive pancreaticoduodenectomies［J］.Ann Surg，2006，244(1):10.

［3］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58(2):71.

［4］Müerk?ster S，Wegehenkel K，Arlt A，et al.Tumor stroma interactions induce chemoresistance in pancreatic ductal carcinoma cells involving increased secretion and paracrine effects of nitric oxide and interleukin-1beta［J］.Cancer Res，2004，64(4):1331.

［5］Banerjee D，Mayer-Kuckuk P，Capiaux G，et al.Novel aspects of resistance to drugs targeted to dihydrofolate reductase and thymidylate synthase［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1587(2-3):164.

［6］Kang HC，Kim IJ，Park JH，et al.Identification of genes with differential expression in acquired drug-resistant gastric cancer cells using high-density oligonucleotide microarrays［J］.Clin Cancer Res，2004，10(1 Pt 1):272.

［7］付斯瑜，李順維.巖舒注射液聯(lián)合化療治療晚期大腸癌的臨床觀察［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2007，7(1):64.

［8］王 兵，王國俊，徐 鈞.氧化苦參堿對腫瘤誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用［J］.實用腫瘤雜志，2000，15(5):297.