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Aes對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

2012-05-30 01:30李明星袁丹丹陳亮李黎博陳柳李榮惠龐曉輝夏洪偉冷衛(wèi)兵唐秋琳畢鋒
中國癌癥雜志 2012年7期
關(guān)鍵詞:劃痕細(xì)胞系結(jié)腸癌

李明星 袁丹丹 陳亮 李黎博 陳柳 李榮惠龐曉輝 夏洪偉 冷衛(wèi)兵 唐秋琳 畢鋒

四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實驗室,

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子靶向治療研究室,△腹部腫瘤科,四川 成都 610041

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素[1],因此研究與肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制是該領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。Aes(amino-terminal enhancer of split,Aes)是轉(zhuǎn)錄因子Groucho/TLE家族成員,能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄,但不具有DNA結(jié)合位點(diǎn)[2]。近期的研究表明Aes能夠通過抑制notch信號通路抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移,且Aes的表達(dá)缺失能夠促進(jìn)結(jié)腸癌的血行轉(zhuǎn)移[3-4],提示Aes在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。為進(jìn)一步探討Aes在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用,我們檢測了Aes在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,通過構(gòu)建Aes表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染其低表達(dá)的肝癌細(xì)胞系HepG2,觀察其對肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、小牛血清,轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM均購自美國Invitrogen公司,兔抗人Aes多克隆抗體購自美國Sigma公司,鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德公司,CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司,RT-PCR試劑盒購自TaKaRa,質(zhì)粒pEGFP-N1為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實驗分組

通過Primer Premier 5.0設(shè)計Aes(NM_001130)的引物,上游引物HindⅢ5’-CCCAAGCTTCCGCGATTGACATGAT-3’、下游引物KpnⅠ 5’-GGGGTACCGTATCCGACTTC TCGCCAT-3’,以cDNA為模板擴(kuò)增Aes片段,雙酶切目的片段,將其連到pEGFP-N1的HindⅢ和KpnⅠ位點(diǎn),通過酶切鑒定以及測序驗證。依照說明書,通過LipofectamineTM2000分別將pEGFP-N1和pEGFP-Aes轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞系HepG2,實驗分pEGFP-N1(對照組)和pEGFPAes(實驗組)。

1.2.2 RT-PCR檢查Aes mRNA的表達(dá)

設(shè)計A e s上下游引物,上游引物:5’-CACCAGGAGGATGATGGCGAG-3’,下游引物:5’-GGCGTGGAGGTGTCTGGAACTA-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物為560 bp。以GADPH為內(nèi)參,其上游引物序列為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT G-3’,下游引物序列為5’-AGGGGCCAT CCACAGTCTTC-3’。TRIzol試劑提取待測細(xì)胞的總RNA,取一定量的RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后,進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán),72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測不同細(xì)胞系中Aes的表達(dá)及外源Aes的表達(dá)

收集對數(shù)期生長的待測細(xì)胞及轉(zhuǎn)染48 h之后的細(xì)胞,RIPA裂解液重懸細(xì)胞并反復(fù)吹打,超聲破碎后,4 ℃,134 00×g,離心15 min。取上清液作為細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。取一定量的蛋白樣品40 μg,進(jìn)行12%SDSPAGE;260 mA濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗4 ℃溫育過夜,TBST洗滌3次,加入二抗避光溫育,搖床2 h,Odyssey紅外激發(fā)掃描成像系統(tǒng)掃描成像結(jié)果。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察蛋白定位

轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-Aes的細(xì)胞在Nikon熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下,綠色熒光蛋白發(fā)綠光。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測實驗

將細(xì)胞以每孔1×103接種于96孔板中,LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染,每天每組取3孔,每孔避光加10 μL CCK-8,37 ℃溫箱溫育2~4 h,Micro-ELISA儀讀取光密度,選擇490 nm波長,測定各孔吸光值(A),連續(xù)5 d,記錄結(jié)果,以時間為橫坐標(biāo),A490nm值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

以每孔2×105個細(xì)胞接種對數(shù)生長期細(xì)胞于6孔板中,第2天分別用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-Aes,用移液槍頭分別在培養(yǎng)板底部呈一字形劃痕,每天觀察并拍照,鏡下記錄劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移情況,軟件分析劃痕區(qū)的相對距離,并計算其相對遷移率:(第0天記錄的相對距離-第3天記錄的相對距離)/第0天記錄的相對距離×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力

將BD hanging cell culture inserts置入24孔板中,將BD Matrigel Basement Membrance Matrix 按1∶3的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋,取35 μL鋪入小室底層,37 ℃放置2 h使其凝固;收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,將1×104個細(xì)胞250 μL加入小室,下層培養(yǎng)板中加入700 μL含小牛血清20%的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后用棉簽拭去小室上層細(xì)胞,HE染色,顯微鏡下觀察侵襲的細(xì)胞數(shù)目,分15個視野對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析,用表示,樣本間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aes在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

通過RT-PCR和Western blot檢測肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721中Aes的mRNA和蛋白表達(dá)(圖1),發(fā)現(xiàn)相對于SMMC-7721,Aes在HepG2中的表達(dá)明顯降低。因此,我們在隨后的試驗中選擇HepG2作為研究對象,觀察了Aes對HepG2惡性生物學(xué)行為的影響。

2.2 pEGFP-Aes重組蛋白表達(dá)載體構(gòu)建、酶切鑒定

將構(gòu)建好的pEGFP-Aes分別經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切后電泳,可見593 bp(Aes編碼區(qū)片段大小)的片段(圖2)。

2.3 pEGFP-Aes在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)鑒定

通過Western blot檢測轉(zhuǎn)入的pEGFP-Aes的表達(dá),在熒光顯微鏡下觀察Aes在細(xì)胞中的定位,發(fā)現(xiàn)Aes在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá),并且能在細(xì)胞核中形成點(diǎn)狀濃積(圖3)。

2.4 Aes對肝癌細(xì)胞HepG2生物學(xué)行為的影響

2.4.1 Aes對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響

將pEGFP-N1、pEGFP-Aes分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性,發(fā)現(xiàn)與pEGFP-N1組相比,pEGFP-Aes對肝癌細(xì)胞HepG2的增殖并無顯著影響(圖4)。

2.4.2 Aes抑制肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲能力

同pEGFP-N1組相比,轉(zhuǎn)染了pEGFP-Aes的肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖5,表1)。

2.4.3 Aes抑制肝癌細(xì)胞HepG2的遷移能力

pEGFP-N1組劃痕區(qū)明顯變窄,而pEGFPAes組腫瘤細(xì)胞劃痕間距離基本沒有變化,遷移率明顯降低(P<0.05,圖6,表1),說明Aes能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞遷移。

表 1 pEGFP-Aes對HepG2侵襲遷移能力的影響Tab.1 The effect of pEGFP-Aes on the invasion and migration of transfected HepG2 cells

3 討 論

Groucho/TLE家族主要是通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達(dá),Aes是該家族的重要成員之一,但其本身并不具有DNA結(jié)合位點(diǎn),在成骨、神經(jīng)及眼的發(fā)育過程中起重要作用[5-7]。早期的研究表明,Aes能夠通過調(diào)節(jié)TCF/LEF-1的活性來激活Wnt信號通路,從而進(jìn)一步參與調(diào)控發(fā)育[8]。

目前,關(guān)于Aes的報道較少,其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中所起的作用尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞質(zhì)中,Aes能與線粒體蛋白Bit1結(jié)合誘導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[9],近期的研究表明,Aes在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中扮演重要角色,Aes的表達(dá)缺失可能是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素,但Aes不參與調(diào)控結(jié)直腸腫瘤的生長[4]。

Aes是否在肝癌轉(zhuǎn)移中也起著至關(guān)重要的作用目前尚不清楚。本研究首先檢測了不同肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721中Aes的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)無論是mRNA水平還是蛋白水平,Aes在HepG2中都比較低,由此我們構(gòu)建pEGFPAes表達(dá)載體,在HepG2細(xì)胞中Aes過表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aes能夠在細(xì)胞核中形成點(diǎn)狀濃積。根據(jù)文獻(xiàn)報道,Aes在細(xì)胞核內(nèi)可以募集轉(zhuǎn)錄因子,形成難溶的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物,抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄[3]。我們在熒光顯微鏡下看到的點(diǎn)狀濃積可能是Aes與其他轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合抑制基因轉(zhuǎn)錄的復(fù)合物,但Aes結(jié)合的是哪些轉(zhuǎn)錄因子,是否在行使其抑制轉(zhuǎn)錄因子的功能還有待進(jìn)一步研究。此外,轉(zhuǎn)入Aes能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲和遷移,在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。以往研究證明,Aes能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中Notch信號通路,而Notch信號通路與腫瘤的侵襲和遷移有很大聯(lián)系,例如Notch通路中的配體Notch1表達(dá)下調(diào)將會抑制NF-κB的活性,進(jìn)而抑制VEGF和MMP-9的表達(dá)[10-11],但此種推斷尚需要進(jìn)一步的實驗 證實??傊芯緼es在抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移方面所起的重要作用,能夠為肝癌的治療和預(yù)后提供一個新的靶點(diǎn)。

[1]AKRIVIADIS E A, LLOVET J M, EFREMIDIS S C, et al.Hepatocellular carcinoma [J].Br J Surg, 1998, 85(10):1319-1331.

[2]BEAGLE B, JOHNSON G V W.AES/GRG5: More than just a dominant-negative TLE/GRG family member [J].Dev Dyn,2010, 239(11): 2795-2805.

[3]SONOSHITA M, AOKI M, FUWA H ,et al.Suppression of colon cancer metastasis by Aes through inhibition of Notch signaling [J].Cancer Cell, 2011, 19(1): 125-137.

[4]CHRISTOFORI G.Metastatic colon cancer cells negotiate the intravasation Notch [J].Cancer Cell, 2011, 19(1): 6-8.

[5]ZHU C C, DYER M A, UCHIKAWA M, et al.Six3-mediated auto repression and eye development requires its interaction with members of the Groucho-related family of co-repressors[J].Development, 2002, 129(12): 2835-2849.

[6]ZHANG X, CHEN H M, JARAMILLO E, et al.Histone deacetylase-related protein inhibits AES-mediated neuronal cell death by direct interaction [J].J Neurosci Res, 2008,86(11): 2423-2431.

[7]GHOSH-DASTIDAR S, NARAYANAN S, STIFANI S, et al.Transducin-like enhancer of split-1 (TLE1) combines with forkhead box protein G1 (FoxG1) to promote neuronal survival[J].J Biol Chem, 2012, 287(18): 14749-59.

[8]ROOSE J, MOLENAAR M, PETERSON J, et al.The xenopus Wnt effector XTcf-3 interacts with Groucho-related transcriptional repressors [J].Nature, 1998, 395(6702):608-612.

[9]JAN Y, MATTER M, PAI J T, et al.A mitochondrial protein,Bit, mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressors [J].Cell, 2004, 116(5): 751-762.

[10]WANG Z, BANERJEE S, LI Y, et al.Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factorkappaB, vascular endothelial growth factor, and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells [J].Cancer Res, 2006, 66(5): 2778-2784.

[11]WANG Z, LI Y, BANERJEE S, et al.Down-regulation of Notch-1 and Jagged-1 inhibits prostate cancer cell growth,migration and invasion, and induces apoptosis via inactivation of Akt, mTOR, and NF-kappaB signaling pathways [J].J Cell Biochem, 2010, 109(4): 726-736.

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