陽(yáng)志軍 俸艷英 張瑋 李力

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021

本研究組前期研究，已從用卵巢上皮癌患者腹水癌細(xì)胞構(gòu)建的文庫(kù)中，篩選出脆性X染色體相關(guān)基因1(fragile X-related gene 1, FXR1)等6個(gè)卵巢癌相關(guān)抗原基因［1］，同時(shí)卵巢上皮癌患者外周血檢測(cè)FXR1抗體也明顯高于卵巢良性腫瘤和正常對(duì)照［2］，因而提示FXR1基因可能在卵巢癌發(fā)生發(fā)展發(fā)揮某些生物學(xué)作用，為進(jìn)一步探討FXR1基因表達(dá)與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及臨床意義，本研究組檢測(cè)了不同卵巢組織中的FXR1mRNA表達(dá)并采用真核轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)不表達(dá)FXR1的HO8910細(xì)胞中FXR1基因的表達(dá)，了解其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

所有組織標(biāo)本均采集于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科收治的手術(shù)治療患者。組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后立即凍于液氮保存?zhèn)溆?，并?jīng)病理確診。36例卵巢癌均為上皮性癌，其中漿液性癌26例，黏液性癌7例，子宮內(nèi)膜樣癌2例，透明細(xì)胞癌1例；Ⅰ期7例，Ⅱ期12例，Ⅲ期17例；高分化13例，中、低分化23例。卵巢良性腫瘤15例；正常卵巢組織13例。卵巢癌患者年齡17～66歲，中位年齡46歲。卵巢良性腫瘤患者年齡14～67歲，中位年齡43.5歲，正常卵巢組織取材對(duì)照組年齡30～54歲，中位年齡45歲。

1.2 載體、菌種、細(xì)胞、cDNA模板

pEGFP-N1、pCDNA3.1真核表達(dá)質(zhì)粒，購(gòu)自Invitrogen公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系HO8910、卵巢癌cDNA模板由本研究室保存［3］。

1.3 主要試劑

TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，Revert AidTMFirst Strand cDNA 合成試劑盒和100 bp DNA ladder購(gòu)自MBI Fermentas公司，dNTP mixture(2.5 mmol/L)、25 mmol/L MgCl2溶液購(gòu)自上海生工生物工程公司。Wizard?Plus Midipreps DNA提純系統(tǒng)、G418購(gòu)自美國(guó)Promega(北京)生物技術(shù)有限公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Tiangen公司，BamHⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB(北京吉泰生物科技有限公司)，LipofectamineTM2000 Transfection reagent購(gòu)自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司，BD MatrigelTMMatrix、Fibronectin購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences(上海)有限公司。引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank應(yīng)用設(shè)計(jì)軟件Primer5設(shè)計(jì)引物，克隆引物加入BamHⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，F(xiàn)XR1全長(zhǎng)克隆引物順義鏈：5’-ATAAGAATGCGGCCG CCCAACATGGCGGACGTGACGGTG-3’，反義鏈：5’-CGCGGATCCACTGAAACACCAT T C A G G A C T G C T G-3’，產(chǎn)物大小為1 620 bp；表達(dá)檢測(cè)引物順義鏈：5’-GGCTAAA GTTCGGATGATG-3’，反義鏈：5’-ATGAAAA GCTGCTGCAAG-3’，產(chǎn)物大小為410 bp。參照基因GAPDH順義鏈：5’-GAAGGTG AAGGTCGGAGT-3’，反義鏈：5’-GAAGATGGT GATGGGATTT- 3’，產(chǎn)物大小為225 bp。

1.4 方法

1.4.1 RT-PCR法檢測(cè)卵巢組織中FXR1 mRNA表達(dá)

采用半定量RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)［4］。

1.4.2 pCDNA3.1/FXR1真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以卵巢癌組織cDNA為模板，用RT-PCR法擴(kuò)增FXR1基因 CDS全長(zhǎng)，將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠下電泳分離，切膠回收目的DNA。將pCDNA3.1質(zhì)粒、目的DNA用BamHⅠ、NotⅠ雙酶切并回收，用連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在氨芐抗性LB平板篩選培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用BamHⅠ、NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定。送生物公司進(jìn)行測(cè)序并blast比對(duì)鑒定。對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒按無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取質(zhì)粒，產(chǎn)物分裝后-20 ℃保存。

1.4.3 pCDNA3.1質(zhì)粒pEGFP-N1、pCDNA3.1/FXR1重組子的真核轉(zhuǎn)染

毒性試驗(yàn)確定G418在HO8910細(xì)胞系的篩選濃度，首先采用胰酶消化指數(shù)增長(zhǎng)期的HO8910細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，在細(xì)胞完全貼壁(約20%滿)后按終濃度為100～1 000 μg/mL的遞增濃度梯度加入G418，連續(xù)培養(yǎng)10～14 d，以細(xì)胞全部死亡的最小G418濃度為下一步實(shí)驗(yàn)的篩選濃度。

在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下，pEGFP-N1、pCDNA3.1及pCDNA3.1/FXR1的真核轉(zhuǎn)染具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)［5］。

1.4.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)塊的篩選及鑒定

胰酶消化篩選經(jīng)G418篩選剩余的散在的細(xì)胞團(tuán)塊，在倒置顯微鏡直視下用Tip頭將細(xì)胞團(tuán)吸出，稀釋后接種在96孔板中，細(xì)胞貼壁后將單個(gè)細(xì)胞的孔標(biāo)記出，用半量篩選濃度繼續(xù)保持G418抗性篩選擴(kuò)大培養(yǎng)，并經(jīng)RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)，最后凍存保種后，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)轉(zhuǎn)后細(xì)胞分別命名為pCDNA3.1及pCDNA3.1/FXR1。

1.4.5 FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞生物學(xué)功能影響的檢測(cè)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線采用MTT法進(jìn)行繪制；細(xì)胞生長(zhǎng)周期采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析；細(xì)胞體集落形成能力采用平板克隆形成計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)；細(xì)胞體外遷移、侵襲和黏附能力測(cè)定分別采用Transwell小室，Matrigel和細(xì)胞混合基質(zhì)(粘連蛋白和膠原蛋白)黏附法，具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各類卵巢組織中FXR1表達(dá)及與卵巢上皮癌臨床病理的關(guān)系

FXR1 mRNA在卵巢癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平比卵巢良性腫瘤組織及正常卵巢組織均高，癌組織中的表達(dá)水平與良性腫瘤組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)；癌組織中的表達(dá)水平與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 9)；癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平與非癌組織相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)；FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期的癌組織中FXR1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于Ⅲ期，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)；高分化組織中的表達(dá)水平低于中、低分化組織，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037，表1)。

表 1 FXR1 mRNA在不同卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)水平與卵巢上皮癌臨床病理的關(guān)系Tab.1 Relative expression level of FXR1 mRNA in different ovarian tissues and related with clinical-pathology

2.2 pCDNA3.1/FXR1(OV-178)真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

重組陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、NotⅠ雙酶切后有與目的片段大小吻合的基因片段(圖1)，經(jīng)測(cè)序鑒定質(zhì)粒中插入的FXR1(OV-178)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中FXR1基因的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，顯示在第9～10位堿基上出現(xiàn)了無(wú)義突變GC/CG。提示成功構(gòu)建pCDNA3.1/FXR1重組質(zhì)粒。

2.3 耐G418細(xì)胞團(tuán)塊的篩選

經(jīng)毒性試驗(yàn)最終確定G418的篩選濃度為400 μg/mL。轉(zhuǎn)染后pEGFP-N1質(zhì)粒8 h后在熒光顯微鏡下拍照估計(jì)轉(zhuǎn)染效率為30%～40%。經(jīng)終濃度為400 μg/mL的G418篩選12 d，大部分細(xì)胞均死亡，僅有散在的細(xì)胞團(tuán)塊存活，這些細(xì)胞團(tuán)塊具有G418抗性(圖2)。

2.4 RT-PCR法及Western blot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株

將耐G418細(xì)胞團(tuán)塊胰酶消化、稀釋后接種的單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，用RT-PCR檢測(cè)了FXR1在這些克隆中的表達(dá)，結(jié)果在6個(gè)克隆中有4個(gè)克隆中FXR1的表達(dá)明顯升高(圖3)。并經(jīng)Western blot檢測(cè)到FXR1蛋白的表達(dá)(圖4)。

2.6 FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞平扳克隆形成能力的影響

轉(zhuǎn)染pCDNA3.1/FXR1質(zhì)粒后，平均克隆形成為(93.5±4.4)個(gè)，多于轉(zhuǎn)染pCDNA3.1質(zhì)粒后的平均克隆數(shù)［(83.5±4.0)個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表 2 平板克隆計(jì)數(shù)Tab.2 Quantity of clone formation in plate

2.7 FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析的細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒細(xì)胞(83%)相比轉(zhuǎn)染FXR1基因后G1期細(xì)胞比例明顯減少(67.1%)，而S期及G2期細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多(表3)。

表 3 FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞周期的影響Tab.3 Cell cycle of HO8910 after transfected

2.8 FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞體外侵襲能力及遷移能力的影響

經(jīng)DAPI染色后在熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)能降解Matrigel穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)不多。轉(zhuǎn)染FXR1基因與轉(zhuǎn)染空載體相比，穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表 4 FXR1對(duì)HO8910體外細(xì)胞侵襲能力的影響Tab.4 Quantity of cell invasion

FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞體外遷移能力的影響，與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染FXR1基因的細(xì)胞穿過(guò)濾膜的相對(duì)細(xì)胞數(shù)相當(dāng)(表5)。

表 5 FXR1對(duì)HO8910細(xì)胞體外遷移能力的影響Tab.5 Relative quantity of cell migration

2.8 FXR1基因?qū)O8910細(xì)胞基質(zhì)黏附試能力的影響

轉(zhuǎn)染pCDNA3.1/FXR1質(zhì)粒后細(xì)胞對(duì)基質(zhì)相對(duì)黏附能力比轉(zhuǎn)染pCDNA3.1質(zhì)粒的細(xì)胞要強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表6)。

表 6 FXR1對(duì)HO8910細(xì)胞黏附能力的影響Tab.6 Relative ratio of cell adhesion

3 討 論

FXR1是脆性X智力遲鈍相關(guān)基因家族中的一員，該家族基因均有RNA綁定，與多聚核糖體相關(guān)，在核與細(xì)胞質(zhì)間穿梭的生理功能。FXR1與大部分核糖體60S亞單位有關(guān)［6］。同時(shí)FXR1 3’-UTRS的富含AU元件(AREs)是對(duì)轉(zhuǎn)錄后有很強(qiáng)調(diào)節(jié)能力的信號(hào)，可影響mRNA的穩(wěn)定和翻譯，并可明顯改變基因表達(dá)產(chǎn)生不同的臨床及分化后果。因此FXR1具有細(xì)胞生長(zhǎng)依賴的翻譯活性功能［7］。FXR1在凋亡細(xì)胞中從細(xì)胞質(zhì)中原來(lái)與核糖體相關(guān)的結(jié)合部位發(fā)生移動(dòng)，并形成一些類似于典型的水泡樣細(xì)胞器，認(rèn)為正是這種定位上的改變及細(xì)胞凋亡過(guò)程中蛋白酶對(duì)FXR1進(jìn)行裂解，使一些原來(lái)隱藏的抗原表位顯露出來(lái)是引起機(jī)體免疫反應(yīng)的原因［8］。Comtesse等［9］用芯片技術(shù)對(duì)鱗狀細(xì)胞癌中3q25-28區(qū)域直接或間接與翻譯起始有關(guān)基因在表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于擴(kuò)增區(qū)域中心有包括FXR1在內(nèi)的3個(gè)基因在鱗狀細(xì)胞癌中有很高的過(guò)表達(dá)率，而與真核翻譯起始因子4A1、4B2等在所有肺癌標(biāo)本中均過(guò)表達(dá)，這提示FXR1對(duì)翻譯活性的調(diào)節(jié)功能可能與細(xì)胞癌變有關(guān)。本研究在卵巢癌組織中亦檢測(cè)到FXR1的表達(dá)明顯高于良性腫瘤及正常卵巢組織，并且與臨床期別及組織分化程度相關(guān)。可能FXR1在卵巢癌組織中的高表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中加強(qiáng)RNA轉(zhuǎn)運(yùn)，提高細(xì)胞翻譯活性有關(guān)。

本研究采用基因克隆的方法成功構(gòu)建了FXR1真核表達(dá)載體，用傳統(tǒng)的基因替代技術(shù)將FXR1基因的真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系，使不表達(dá)FXR1基因的HO8910細(xì)胞系高表達(dá)，研究FXR1對(duì)HO8910生物學(xué)功能的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR1基因可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，這也證實(shí)了FXR1具有細(xì)胞生長(zhǎng)依賴的翻譯活性功能，這種翻譯活性可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖起正向調(diào)節(jié)作用?；|(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)提示上調(diào)FXR1基因可加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的黏附能力，而RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)臨床分期Ⅲ期的卵巢癌組織中FXR1基因的表達(dá)明顯高于早期癌組織，可能 FXR1上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的黏附而利于病變進(jìn)展有關(guān)；同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)FXR1對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的能力無(wú)明顯影響，細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜、多因素參與的過(guò)程，細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的黏附只是其中的一個(gè)環(huán)節(jié)，有關(guān)FXR1基因與卵巢細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系需進(jìn)一步證實(shí)。流式細(xì)胞周期檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染FXR1基因的細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯減少，這說(shuō)明轉(zhuǎn)染FXR1后細(xì)胞的增殖更旺盛，上調(diào)FXR1基因可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，與生長(zhǎng)曲線及克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相吻合。這一結(jié)果只是從上調(diào)FXR1基因的表達(dá)得出的，還需從下調(diào)FXR1基因的表達(dá)來(lái)反向確證。

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