俞立萍 李萍 章青 徐文才 李兆斌 傅深

頭頸鱗癌是世界第6大惡性腫瘤，在我國年發(fā)病率可達(dá)15.22/10萬，排在惡性腫瘤發(fā)病的第7位。早期的頭頸鱗癌對單一的手術(shù)或者放療效果較好。然而，超過一半的頭頸部鱗癌患者首次就診時就已經(jīng)處于晚期階段，故5年生存率低于50%。以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物作為放療增敏劑能提高治愈率，卻會導(dǎo)致更嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡率。所以，尋找一種新的靶向頭頸鱗癌的治療方法至關(guān)重要。胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)是酪氨酸蛋白激酶家族的成員，在各種類型細(xì)胞上均有表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增生、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)，在頭頸鱗癌中高表達(dá)［1-3］。

本研究擬設(shè)計體外實驗，研究IGF-1R抑制劑AG1024在體內(nèi)外對人咽鱗癌FaDu細(xì)胞的放射增敏作用，并分析其產(chǎn)生放射增敏的可能機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 主要藥物和試劑

MEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自Hyclone公司，AGl024購自德國Calbiochem公司，AnnexinⅤ-FITC/PI購自Invitrogen公司，γ-H2AX抗體購自Millipore公司。蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)及免疫沉淀所用抗體購自cell signaling 公司, protein-A/G beads購自碧云天公司。

1.2 FaDu細(xì)胞的培養(yǎng)

頭頸鱗癌FaDu細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。所有實驗均在細(xì)胞處于對數(shù)增長期時進(jìn)行。

1.3 克隆形成實驗檢測細(xì)胞集落形成情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，10 μmol/L AG1024溫育處理細(xì)胞24 h后，6 MV X線分別照射0、2、4、6、8、10 Gy，1 h后按不同濃度梯度接種于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2周。細(xì)胞集落經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定以及0.1%結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成情況。以含>50個細(xì)胞的集落計為1個存活克隆，計數(shù)各組細(xì)胞的克隆數(shù)。應(yīng)用Sigma plot多靶單擊模型擬和存活曲線。

1.4 AnnexinⅤ-FITC/PI 雙標(biāo)記法分析細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期FaDu細(xì)胞接種于6孔板。培養(yǎng)24 h后，分別給予如下處理： ①對照組，不處理；②放射組，給予6 MV X線 4 Gy照射；③AG1024組，給予10 μmol/L AG1024；④聯(lián)合組，給予10 μmol/L AG1024溫育1 h，給予6 MV X線 4 Gy照射。各組于24 h后用胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞。用500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞后，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC/PI混勻，再加入5 μL碘化丙啶(propidiumiodide，PI)混勻，避光反應(yīng)15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 PI單染法分析周期分布

細(xì)胞收集方法如上，預(yù)冷的70%酒精固定過夜，再用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入50 μg/mL的用PBS稀釋的PI工作液，避光冰浴30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.6 γ-H2AX形成實驗分析DSBs修復(fù)情況

取對數(shù)生長期細(xì)胞于24孔板內(nèi)爬片，培養(yǎng)24 h后加入10 μmol/L AG1024溫育24 h，6 MV X線 4 Gy照射。于照射后0.5、1、6、24 h分別固定，破膜，封閉，染色，檢測γ-H2AX焦點的表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察計數(shù)γ-H2AX焦點形成數(shù)，計數(shù)50個細(xì)胞取平均值。

1.7 Western blot檢測IGF-1R下游活化蛋白pAkt和pErk1/2的表達(dá)

用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌各組細(xì)胞3次后，冰上裂解蛋白30 min，收集蛋白裂解液，12 000×g離心15 min，收集上清液。采用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白與5倍的上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，蛋白上樣量為20 μg，行SDSPAGE分離蛋白；然后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用5%脫脂牛奶于室溫下封閉l h，TBST緩沖液清洗3次(每次5 min)；分別加入相應(yīng)一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖晃培育過夜后，TBST清洗3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔或鼠二抗(1∶5 000稀釋)，室溫溫育l h，TBST清洗3次；電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影約5 min，曝光反應(yīng)。

1.8 動物實驗

4～6周齡的裸鼠，右下肢皮下注射2×107的細(xì)胞懸液0.1 mL，V=π/6ab2，其中a為長軸直徑，b為其垂直的短軸直徑。到腫瘤長至100 mm3時分成4組：對照組；AG1024組；放射組；聯(lián)合組。AG1024每周使用5次，每次用量為30 μg 腹腔注射，使用2周，第1、8天分別用8 Gy照射，共照射2次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均重復(fù)3次，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AG1024對FaDu細(xì)胞克隆形成的影響

FaDu細(xì)胞經(jīng)AG1024溫育24 h后接受照射與放射組比較，其存活曲線明顯下降，肩區(qū)變窄。放射組的D0值為2.44，聯(lián)合組下降為1.77。細(xì)胞在10%存活處的DMF為1.25。AG1024可以提高FaDu細(xì)胞的放射敏感性(圖1)。

2.2 AG1024對FaDu細(xì)胞凋亡的影響

對照組凋亡細(xì)胞比例為(1.97±0.60)%，放射組為(3.2±0.99)%，AG1024組為(4.50±0.38)%，聯(lián)合組為(9.68±0.53)%。聯(lián)合組細(xì)胞凋亡明顯高于放射組及AG1024組(P<0.05，圖2)。

2.3 AG1024對FaDu細(xì)胞周期分布的影響

FaDu 細(xì)胞經(jīng)過不同的處理后，其細(xì)胞周期發(fā)生了改變(圖3)。細(xì)胞經(jīng)過藥物處理后，S期細(xì)胞減少；聯(lián)合照射后，能進(jìn)一步使G0/G1期細(xì)胞比例升高，細(xì)胞阻滯于G0/G1期。與放射組相比，聯(lián)合組的細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯(P<0.05)，S期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)。

2.4 γ-H2AX形成實驗DSBs修復(fù)情況

聯(lián)合組FaDu細(xì)胞經(jīng) AG1024溫育24 h后，6 MV X線4 Gy照射，放射后0.5、1、6、24 h的γ-H2AX焦點形成數(shù)為(35.20±5.93、33.10±6.71、25.92±5.79和13.33±3.93)，照射組為(32.91±5.83、31.68±6.02、20.72±6.09和3.43±2.04)。照射后0.5、1、6 h兩組焦點數(shù)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。照射24 h后，聯(lián)合組的焦點數(shù)明顯多于放射組(P<0.05)。AG1024能抑制DSBs的修復(fù)(圖4)。

2.5 AG1024對IGF-1R下游活化蛋白pAkt和pErk1/2表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，10 μmol/L AG1024處理FaDu細(xì)胞后，AG1024組以及聯(lián)合組的IGF-1R下游的活化蛋白pAkt和pErk1/2表達(dá)下降(圖5)。

2.6 AG1024對荷瘤小鼠腫瘤生長情況的影響

腫瘤體積雙倍時間在對照組、放射組、AG1024組及聯(lián)合組分別為4.3±0.21、7.1±0.25、5.2±0.19和10.9±0.24，與放射組和AG1024組相比，聯(lián)合組的腫瘤生長延遲(P<0.05，圖6)。

3 討 論

頭頸鱗癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，進(jìn)年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及分子靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，靶向治療日漸成為頭頸鱗癌治療的重要選擇。其中EGFR在95%～100%的頭頸鱗癌中存在過表達(dá)。放療或者化療聯(lián)合EGFR的靶向治療在頭頸鱗癌的治療中取得一定的成效，但是臨床發(fā)現(xiàn)有很大一部分患者存在EGFR耐藥［4］。針對EGFR靶點治療的局限性，尋找頭頸鱗癌的更多的相關(guān)靶點的治療勢在必行。其中IGF-1R作為酪氨酸蛋白激酶家族的成員，在頭頸鱗癌中多是高表達(dá)，Jun等［5］發(fā)現(xiàn)IGF-1R的高表達(dá)和進(jìn)展患者的生存率相關(guān)，提示抑制IGF-1R可以作為頭頸鱗癌治療的相關(guān)靶點。

本研究結(jié)果顯示，AG1024阻斷IGF-1R后，能增加頭頸鱗癌FaDu細(xì)胞的放射敏感性，可能和其能增強(qiáng)放療引起的細(xì)胞凋亡，并能引起細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，使得細(xì)胞處在靜止期，減少其細(xì)胞的分裂和增殖，而對放射不敏感的S期細(xì)胞則明顯減少有關(guān)。進(jìn)一步通過檢測DNA雙鍵斷裂(DSBs)修復(fù)的情況以及IGF-1R下游蛋白的活化水平表明。AG1024能延緩DSBS的修復(fù)，并阻斷P13K/Akt及Ras/Raf/MAPK信號通路。其中DSBs被認(rèn)為是DNA最嚴(yán)重的損傷，射線引起的細(xì)胞損傷主要是DSBs從而進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡以及增殖性死亡。當(dāng)DSBs時，H2AX在139位迅速發(fā)生磷酸化(γ-H2AX) ，并在斷裂附近形成焦點，而在DSBs修復(fù)后迅速發(fā)生去磷酸化。所以γ-H2AX形成的數(shù)量可作為衡量DSBs的指標(biāo)［6-7］。有報道指出，IGF-1R抑制劑可通過下調(diào)BRCA2這個DNA損傷后同源修復(fù)(HR)的關(guān)鍵蛋白使得DSBs修復(fù)不足，導(dǎo)致高放射敏感性［7-8］。從克隆形成實驗可見AG1024有放射增敏作用，但對DSBs這個射線引起的最主要的DNA致死性損傷的作用至今還沒有被評估。所以我們檢測了射線引起DSBs后AG1024在DSBs修復(fù)上的作用。在接受照射后，30 min到1 h γ-H2AX焦點形成數(shù)達(dá)到最高，之后隨著DSBs的修復(fù)，γ-H2AX焦點數(shù)開始下降。在照射后0.5、1和6 h，焦點數(shù)沒有明顯差異，但是在24 h后，AG1024組的γ-H2AX焦點數(shù)明顯比非處理組高，即DSBs的修復(fù)被抑制，增加放射敏感性。而P13K/Akt及Ras/Raf/MAPK信號通路與細(xì)胞的生存、分化、增殖和凋亡等密切相關(guān)，并與放療阻抗相關(guān)。AG1024能抑制Akt和MAPK的磷酸化，從而能抑制IGF-1R介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化等。而動物實驗的結(jié)果則進(jìn)一步驗證了藥物聯(lián)合放療能抑制頭頸腫瘤FaDu細(xì)胞的增殖。

綜上所述，IGF-1R抑制劑AG1024能抑制DSBs的修復(fù)，阻斷P13K/Akt及Ras/Raf/MAPK信號通路，增加放療引起的細(xì)胞凋亡。為臨床尋找有效的以IGF-1R為靶點的頭頸鱗癌治療提供了實驗依據(jù)。

［1］RESNICOFF M, ABRAHAM D, YUTANAWIBOONCHAI W,et al.The insulin-like growth factor I receptor protects tumor cells from apoptosis in vivo［J］.Cancer Res, 1995, 55:2463-2469.

［2］BASERGA R.The insulin-like growth factor-Ⅰ receptor as a target for cancer therapy［J］.Expert Opin Ther Targets,2005, 9: 753-768.

［3］POLLACK M N, SCHERNHAMMER E S, HANKINSON S E,et al.Insulin-like growth factors and neoplasia［J］.Nat Rev Cancer, 2004, 4: 505-518.

［4］MEHRA R, SEREBRIISKII I G, DUNBRACK R L, et al.Protein-intrinsic and signaling network-based sources of resistance to EGFR- and ErbB family-targeted therapies in head and neck cancer［J］.Drug Resist Updat, 2011, 14(6):260-279.

［5］JUN H, CHANG M, KO Y, et al.Clinical significance of type 1 insulin-like growth factor receptor and insulin-like growth factor binding protein-3 expression in squamous cell carcinoma of head and neck［J］.J Clin Oncol, 2009, 27(15):6036.

［6］ROGAKOU E P, BOON C, REDON C, et al.Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo［J］.J Cell Biol, 1999, 146: 905-916.

［7］SCHULTZ L B, CHEHAB N H, MALIKZAY A, et al.p53 binding protein 1(53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double strand breaks［J］.J Cell Biol,2000, 151: 1381-1390.

［8］YU D, SEKINE E, FUJIMORI A, et al.Down regulation of BRCA2 causes radio-sensitization of human tumor cells in vitro and in vivo［J］.Cancer Sci, 2008, 99: 810-815.