郝鳳奇，李景梅*，楊桂連

(1.長春理工大學生命科學技術(shù)學院，吉林 長春 130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118)

乳酸菌作為人和動物消化道內(nèi)的正常菌群，被公認為“安全級”的微生物[1]。構(gòu)建乳酸菌質(zhì)粒表達載體對于制備功能性重組乳酸菌至關(guān)重要。Nisin為由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌的一種小分子抗生物肽，由34個氨基酸組成，分子量約為3.5 ku，能夠抑制多數(shù)食品腐敗菌的生長，對人和動物無害，是一種高效、無毒的天然食品防腐劑[2]。Nisin生物合成的基因簇包括：nisABTCIPRKFEG，nisR與nisK構(gòu)成雙組分調(diào)控元件。Nisin的合成遵循密度感受原理，首先，nisR的組成型啟動子持續(xù)啟動nisK表達組氨酸激酶(NisK)，同時nisR自身編碼應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(NisR)；其次，NisK為膜結(jié)合感應(yīng)蛋白，其N末端位于細胞外，可在少量Nisin存在時，發(fā)生自身磷酸化，并將磷酸基團傳遞給細胞內(nèi)的NisR；最后，磷酸化被激活的NisR可作為轉(zhuǎn)錄激活物啟動下游誘導型啟動子nisA/nisF的基因表達。

本研究將Nisin生物合成的雙組份調(diào)控元件nis-RK基因亞克隆至pW425et中，并以誘導型啟動子nisA基因替換基礎(chǔ)質(zhì)粒中的組成型啟動子P32，構(gòu)建乳酸菌Nisin誘導表達質(zhì)粒載體pW425N，以gfp作為報告基因，檢測載體的誘導表達功能。研究結(jié)果為功能性重組乳酸菌的制備和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒與菌種 分泌型基礎(chǔ)質(zhì)粒pW425et、含有g(shù)fp基因的質(zhì)粒pGEM-T-gfp由吉林農(nóng)業(yè)大學王春鳳教授惠贈；pGEM-T-nisRK由本研究室構(gòu)建[3]；豬源嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)分離自仔豬腸道，產(chǎn)NisinL.lactis分離自牛乳，均由吉林農(nóng)業(yè)大學動物微生態(tài)學研究室保存；pMD18-T購自TaKaRa公司；E.coliDH5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶及各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；染色體提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒購自Axygen公司；Nisin購自Sigma公司。

1.3 nisA和gfp基因的克隆與序列分析 根據(jù)GenBank登錄的nisA(AF465351.1)和gfp(U76561.1)基因序列，結(jié)合基礎(chǔ)載體的酶切位點設(shè)計引物，由TaKaRa公司合成。nisA上、下游引物分別為：5'-GGGGAATTCATTAAATTCTGAAGT-3'(EcoRⅠ)、5'-GGGGGATCCTTATTTGCTTACGTG-3'(BamHⅠ)，gfp上、下游引物分別為：5'-GTTCCGCGGATGACC ATGATTACG-3'(SacⅡ)、5'-GGGATCGATTTATTT GTAGAGCTC-3'(ClaⅠ)。提取L.lactis染色體，并以其為模板，PCR擴增nisA基因。以pGEM-T-gfp為模板擴增gfp基因?；厥占兓康幕?，與克隆載體連接，分別構(gòu)建pMD18-nisA和pMD18-gfp，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，篩選陽性重組體進行序列測定，測序結(jié)果采用Blast軟件比對序列相似性。

1.4 nisRK基因穿梭重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用XbaⅠ和KpnⅠ分別對pGEM-T-nisRK和pW425et進行雙酶切，試劑盒回收nisRK基因和pW425et大片段，T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，以紅霉素篩選陽性重組質(zhì)粒，采用酶切和PCR方法鑒定陽性重組質(zhì)粒pW425et-nisRK。

1.5 誘導型啟動子nisA替換組成型啟動子P32采用EcoRⅠ和BamHⅠ分別對pMD18-nisA和pW425et-nisRK進行雙酶切，試劑盒回收nisA基因和pW425et-nisRK大片段(已通過EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切去除組成型啟動子P32)，T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，以紅霉素篩選陽性重組質(zhì)粒，采用酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，并命名為pW425N。

1.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 采用SacⅡ和ClaⅠ分別對pMD18-gfp和pW425N進行酶切，試劑盒回收gfp基因和pW425N載體，T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pW425N-gfp，并電轉(zhuǎn)化L.acidophilus受體菌。

L.acidophilus感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化參照文獻[4]和[5]方法并作適當修改。挑取豬源L.acidophilus菌落接種于新鮮的10 mL MRS液體培養(yǎng)基中(含1%Gly)，37℃厭氧靜止培養(yǎng)至菌體OD600nm值為0.6～0.8。按1%～2%劑量接種于新鮮MRS液體培養(yǎng)基(含1%Gly)，37℃厭氧靜止培養(yǎng)，待菌體OD600nm值為0.2～0.3時，收集菌體培養(yǎng)物冰浴10 min，4℃6000 r/min離心5 min。沉淀以冰冷的清洗緩沖液(1.16 mmol/L Na3PO4、0.09 mmol/L MgCl2)清洗2次；4℃6000 r/min離心5 min收集沉淀，重懸于電擊緩沖液(0.19 mol/L Sucrose、0.3 mmol/L MgCl2)中，冰浴5 min。取200 μL感受態(tài)，加入20 μL重組質(zhì)粒pW425N-gfp，混合后于預(yù)冷的電極杯中(Φ20 mm)，冰浴5 min后進行高壓電轉(zhuǎn)化。冰浴5 min，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)至800 μL新鮮的液體MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜止復蘇4 h～5 h，涂布含有紅霉素(400 μg/mL)的 MRS平板，37℃厭氧靜止培養(yǎng) 16 h～20 h，篩選陽性重組菌擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒采用酶切和PCR方法進行鑒定。

1.7 gfp基因在L.acidophilus中的誘導表達

1.7.1 豬源L.acidophilus對Nisin耐受濃度(RC)和最小抑菌濃度(MIC)的確定 挑取豬源L.acidophilus單個菌落接種于新鮮MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8時，取菌液按1∶100比例分別接種于含有不同有效濃度Nisin(10 ng/mL～60 ng/mL)的MRS培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)過夜后測定菌液OD600nm值，確定受體菌對Nisin的RC和MIC。

1.7.2 Nisin對gfp基因誘導表達時間的確定 將陽性重組菌pW425N-gfp/L.acidophilus接種于MRS培養(yǎng)基中(紅霉素400 μg/mL)，37℃厭氧培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8時，添加有效濃度為10 ng/mL的Nisin進行誘導表達。菌液OD600nm值為0.6～0.8時，記為誘導0 h，添加Nisin后，每隔1 h取菌液，至7 h；將收集的菌液用液體MRS培養(yǎng)基調(diào)OD600nm值為0.6～0.8，4℃ 4000 r/min離心10 min，沉淀用無菌生理鹽水清洗3次，重懸于生理鹽水中。采用熒光分光光度計在激發(fā)光OD460nm波長下測定樣品OD509nm波長下的相對熒光強度，以確定最適誘導表達時間。

1.7.3 gfp基因誘導表達所需Nisin的最佳有效濃度的確定 將陽性pW425N-gfp/L.acidophilus接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8時，向培養(yǎng)基中添加Nisin，使有效濃度分別為10 ng/mL～60 ng/mL；誘導表達后，分別取不同組樣品，測定收集菌液的相對熒光強度。同時，取重組菌菌液100 μL，10倍稀釋后分別進行革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5 Demo進行統(tǒng)計分析和作圖，結(jié)果采用平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 nisA基因和gfp基因的PCR擴增 以提取的L.lactis染色體為模板，PCR擴增nisA基因，擴增片段與預(yù)期大小相符(251 bp)。以pGEM-T-gfp為模板，擴增gfp基因，擴增片段與預(yù)期大小相符(792 bp)。序列測定結(jié)果表明，擴增的目的基因與模板序列(AF465351.1和U76561.1)相似性為100%。

2.2 表達載體pW425N的鑒定 基礎(chǔ)質(zhì)粒pW425et大小為4.8 kb，nisRK基因大小為2.0 kb，重組載體pW425et-nisRK采用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切，分別在4.8 kb和2.0 kb處可見清晰條帶；誘導型啟動子nisA為251 bp，重組載體pW425et-nisRK原組成型啟動子為113 bp，替換啟動子后，大小為6.9 kb，以替換前后的載體為模板進行PCR鑒定，pW425N為模板的泳道在251 bp處可見清晰條帶，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pW425N，分別在6.7 kb和251 bp處可見清晰條帶(圖1)。結(jié)果表明構(gòu)建了乳酸菌Nisin誘導表達載體pW425N(圖2)。將pW425N和gfp基因的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化豬源L.acidophilus，篩選陽性重組菌，提取質(zhì)粒，用SacⅡ和ClaⅠ進行酶切鑒定，結(jié)果在約6.9 kb和792 bp處分別出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)，表明構(gòu)建了重組表達載體pW425N-gfp。

圖1 乳酸菌Nisin誘導表達載體pW425N的鑒定Fig.1 Identification of pW425N by restriction enzyme digestions

圖2 pW425N載體圖譜Fig.2 Map of pW425N

2.3 豬源L.acidophilus對Nisin的RC和MIC 將受體菌L.acidophilus接種于含有不同濃度Nisin的液體MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后測定菌液OD600nm值，結(jié)果表明，RC為40 ng/mL，MIC為60 ng/mL(圖4)。此外，當Nisin有效濃度為10 ng/mL時，受體菌仍然生長良好，因此，以該濃度為標準對gfp基因誘導表達時間進行測定。

圖3 重組載體pW425N-gfp酶切鑒定Fig.3 Identification of pW425N-gfp by digested with enzyme

圖4 豬源L.acidophilus對Nisin的敏感濃度Fig.4 Sensitive concentration ofL.acidophilusfor Nisin

2.4 Nisin對gfp基因的誘導表達時間 以有效濃度為10 ng/mL的Nisin為誘導物，對gfp基因進行誘導表達。結(jié)果表明，非誘導條件下未見綠色熒光，而誘導3 h時綠色熒光蛋白的相對熒光強度達最高值，為341.7±0.20。

2.5 gfp基因誘導表達所需Nisin的最佳濃度 重組菌 pW425N-gfp/L.acidophilu生長至 OD600nm值為0.6～0.8時，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的Nisin，誘導3 h后，測定不同濃度下菌液的相對熒光強度。結(jié)果表明，Nisin的有效濃度為30 ng/mL時綠色熒光蛋白的相對熒光強度達最高值588.5±0.16。

2.6 重組菌pW425N-gfp/L.acidophilus表達GFP的觀察 添加30 ng/mL的Nisin對pW425N-gfp/L.acidophilus誘導3 h后，取菌液100 μL，10倍稀釋后進行革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察，并以不含gfp基因的重組菌pW425N/L.acidophilus做陰性對照。結(jié)果表明，重組菌pW425N-gfp/L.acidophilus在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的綠色熒光(圖5)。

3 討論

圖5 革蘭氏染色和熒光顯微鏡觀察(1000×)Fig.5 Observation by recombinant bacteria by Gram staining and fluorescence microscope(1000×)

啟動子P32為組成型啟動子，是從乳脂鏈球菌中克隆得到，包括開放閱讀框和一個能被E.coli、枯草芽孢桿菌和乳鏈球菌識別的核糖體結(jié)合位點。pMG36e是首個利用啟動子P32構(gòu)建的乳酸菌組成型表達載體，應(yīng)用該載體已表達了溶菌酶、苯丙氨酸酶、枯草桿菌中性蛋白酶、超氧化物岐化酶，以及幽門螺旋桿菌熱休克蛋白A、黏附素Hp0410等抗原蛋白[6-8]。本研究所采用的基礎(chǔ)質(zhì)粒pW425et[9]中含有P32組成型啟動子，利用該載體表達豬A組輪狀病毒VP4、VP7保護性抗原蛋白、新城疫病毒F保護性抗原蛋白和雞白痢沙門氏菌外膜蛋白C等[10-13]，為功能性重組乳酸菌的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本研究構(gòu)建了Nisin誘導型表達載體pW425N。前期工作表明nisRK基因為部分重疊基因，其中的nisR啟動子是一個較強的啟動子[3]。本研究將nisRK基因整合至pW425et中，并在擴增誘導型啟動子nisA基因時，在上下游引物分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，完成啟動子的替換，并且擴增的nisA基因包括啟動子的必須功能區(qū)，即-35區(qū)(ATTAAT)，1 bp～7 bp；-10 區(qū)(TACAAT)，24 bp～29 bp；核糖體結(jié)合位點(TAAGGAGG)，67 bp～74 bp。

Nisin是一種抗生物肽，執(zhí)行誘導前須確定受體菌L.acidophilus對Nisin的RC和MIC，試驗結(jié)果顯示，最高誘導濃度應(yīng)低于60 ng/mL，而當Nisin有效濃度為10 ng/mL時，GFP的相對熒光強度出現(xiàn)在誘導后的3 h，并且表明載體受控嚴格，與Kuipers等研究結(jié)論相符[14]；誘導1 h～3 h，GFP的相對熒光強度與誘導時間呈正相關(guān)，盡管誘導3 h GFP的相對熒光強度出現(xiàn)最大值，但誘導1 h的增加幅度最大，推測可能是與重組蛋白質(zhì)的“代償表達”有關(guān)，有必要進行深入研究。另外，在誘導3 h的條件下，Nisin的最佳有效濃度為30 ng/mL，并且在該濃度以前，GFP的相對熒光強度與Nisin的有效濃度呈現(xiàn)明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，與Willem提出的觀點一致[15]。此外，當Nisin有效濃度大于30 ng/mL時，結(jié)果正相反，可能是因添加的Nisin大于RC導致菌體生長緩慢，GFP表達水平呈下降趨勢，以至于當濃度為60 ng/mL時(MIC)，幾乎檢測不到相對熒光強度。

本研究依據(jù)Nisin生物合成的密度感受原理，以乳酸菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pW425et為基礎(chǔ)質(zhì)粒，構(gòu)建乳酸菌Nisin誘導表達載體pW425N，該載體受控嚴格，表達產(chǎn)物與誘導物之間在一定范圍內(nèi)存在“劑量-效應(yīng)關(guān)系”，為同源或異源功能性蛋白質(zhì)在乳酸菌中的誘導表達和功能性重組乳酸菌制劑的研制提供了可操作的技術(shù)平臺。

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