吾魯木汗·那孜爾別克，張宇鳳，龔鳳娟，恩特馬克·布拉提白

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

禽霍亂是一種主要由血清型A:1、A:3或A:4多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)引起的家禽和野生鳥(niǎo)類(lèi)的接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，預(yù)防禽霍亂的主要措施是接種禽P.multocida的滅活苗和活菌苗。研究表明，強(qiáng)毒株制備的滅活苗只對(duì)同源菌株的感染具有保護(hù)作用，而弱毒株制備的活菌苗雖對(duì)同源菌株和異源菌株的感染具有一定的交叉保護(hù)作用，但存在毒力返強(qiáng)的缺點(diǎn)。因此，研究禽P.multocida致病因子及其致病機(jī)理，對(duì)研制安全有效的活菌苗極為重要。

研究表明細(xì)菌莢膜是致病菌的主要毒力因子[2]。Pruimboom等的研究表明莢膜透明質(zhì)酸是禽P.multocida的粘附因子[3]。Chung等的研究表明禽P.multocidaX-73株莢膜基因位點(diǎn)由莢膜多糖輸出蛋白基因hexABCD、莢膜多糖合成酶基因hyaABCDE和莢膜多糖修飾酶基因phyAB等11個(gè)開(kāi)放閱讀框組成，而hexA基因的缺失突變導(dǎo)致禽P.multocidaX-73株對(duì)小鼠或雞的毒力減弱[4-5]。本實(shí)驗(yàn)以禽P.multocida C48-3株為研究對(duì)象，采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了hexABC基因缺失突變株，通過(guò)小鼠致病性試驗(yàn)檢驗(yàn)莢膜缺陷對(duì)禽P.multocida毒力的影響，為進(jìn)一步開(kāi)展禽P.multocida致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 血清型A∶1禽P.multocidaC48-3株(CVCC458)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌DH5α、pBR322和pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；多功能低拷貝質(zhì)粒pWSK29[6]由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所秦鄂德教授惠贈(zèng)；5周齡雌性清潔級(jí)昆明系小鼠購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒及細(xì)菌基因組提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；RNA prep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒和Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；透明質(zhì)酸酶購(gòu)自Worthington公司；鐵蛋白購(gòu)自Sigma公司；DSA培養(yǎng)基購(gòu)自Difco公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的禽P.multocidaPm70株全基因組序列(AF06727)、pBR322質(zhì)粒序列和pWSK29質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(AF01889)，采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表1)，由TaKaRa公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Oligonucleotide primers

1.4 C48-3株hexABC基因的克隆和測(cè)序 將菌株C48-3接種于TB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒制備基因組DNA。以HexC-F/HexA-R為引物由C48-3株基因組DNA中擴(kuò)增編碼莢膜透明質(zhì)酸輸出蛋白A、B、C的hexABC基因。反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃30 s、67℃30 s、72℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。凝膠回收PCR產(chǎn)物，以SacⅡ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，并連接到pWSK29質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)PCR和酶切鑒定并由TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 以Tet-F/Tet-R為引物由pBR322質(zhì)粒中擴(kuò)增1191 bp的四環(huán)素抗性(TetR)基因。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、68℃30 s、72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。純化PCR產(chǎn)物，以ClaⅠ和PstⅠ酶切并連接至重組質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC中hexC基因的PstⅠ和hexA基因的ClaⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC。經(jīng)PCR鑒定并由TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 突變株的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[7]方法制備C48-3株感受態(tài)細(xì)胞。在2.5 kV/cm、600 Ω和25 μF電轉(zhuǎn)參數(shù)下，將10 μg敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有5 μg/mL四環(huán)素的DSA平板上，37℃培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取8個(gè)單菌落，以引物HexC-IN/HexA-IN進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.7 突變株的交叉引物PCR和序列鑒定 為驗(yàn)證hexABC基因是否被四環(huán)素抗性基因替代而缺失，分別以引物HexC-F/HexA-R、HexC-F/Tet-R、Tet-F/HexA-R、Tet-F/Tet-R、HexC-IN/HexA-IN對(duì)突變株基因組DNA進(jìn)行交叉PCR驗(yàn)證。同時(shí)，將以引物HexC-F/HexA-R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T中，經(jīng)PCR和酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.8 突變株的RT-PCR鑒定 將野生株和突變株分別接種于TB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取RNA，以其為模板采用Random Octamers和Quant Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈，并利用針對(duì)目的基因內(nèi)部序列的HexC-IN/HexA-IN引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.9 突變株的電鏡觀察 參照文獻(xiàn)[8]方法以環(huán)氧樹(shù)脂包埋菌體，制備超薄切片，水化醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察細(xì)菌莢膜結(jié)構(gòu)。

1.10 突變株生物學(xué)特性研究 將菌培養(yǎng)于DSA平板(37℃24 h)，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，并對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色。將菌株接種于TB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1%接種量接種于TB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，每間隔1 h測(cè)定OD600nm值，直至細(xì)菌生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.11 對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn) 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)禽P.multocidaC48-3株對(duì)SPF級(jí)昆明系小鼠的半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果顯示菌株C48-3對(duì)昆明系小鼠的LD50為6.7 cfu。將30只5周齡昆明系小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。C48-3株和突變株在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm值為1.0，稀釋制備3.45×103cfu/mL的菌液，取0.1 mL(50 LD50約為345 cfu)腹腔注射小鼠，陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射相同體積的TB培養(yǎng)基，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 C48-3株hexABC基因的序列分析 以引物HexC-F/HexA-R由C48-3株基因組中擴(kuò)增出大小約為2000 bp的DNA片段(圖1)，與預(yù)期值相符。DNA測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC含有2073 bp的插入片段，其 5'端含有 620 bp的hexC基因下游序列、中間含有798 bp的hexB基因全序列、3'端含有660 bp的hexA基因全序列，與已報(bào)道的禽 P.multocidaX-73株[7]和 Pm70株 hex-ABC基因核苷酸序列同源性為99%。并且C48-3株hexC基因終止密碼子與hexB(JF276224)基因的起始密碼子間存在1個(gè)堿基重疊，hexB基因的終止密碼子與hexA(JF276225)基因起始密碼子間存在4個(gè)堿基重疊。

圖1 禽P.multocidaC48-3株hexABC基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of thehexABCgenes from avian P.multocidaC48-3

2.2 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 以引物Tet-F/Tet-R由pBR322質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增出1191 bp的TetR基因，并連接至重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC的ClaⅠ和PstⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建敲除質(zhì)粒 pWSK29ΔhexABC。以引物HexC-F/HexA-R由重組質(zhì)粒pWSK29-hexABC和敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC中分別擴(kuò)增出大小約為2000bp和1900 bp的DNA片段，以引物Tet-F/Tet-R從敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC中擴(kuò)增出大小約為1200 bp的片段，與預(yù)期值相符(圖2)。DNA測(cè)序結(jié)果表明，TetR基因的上游存在366 bp的hexC基因同源序列，下游存在366 bp的hexA基因同源序列。結(jié)果表明構(gòu)建了敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC。

2.3 突變株的構(gòu)建 將敲除質(zhì)粒pWSK29ΔhexABC電轉(zhuǎn)化C48-3株感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子涂布于含有四環(huán)素的DSA平板上培養(yǎng)，以引物HexC-IN/HexA-IN對(duì)疑似突變株進(jìn)行菌落PCR篩選。PCR結(jié)果顯示，以引物HexC-IN/HexA-IN從野生型C48-3基因組中擴(kuò)增出約1300 bp片段，在8個(gè)轉(zhuǎn)化子中有3個(gè)菌株擴(kuò)增結(jié)果為陰性，選擇1株疑似突變株做進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 突變株的鑒定 通過(guò)交叉引物PCR鑒定突變株的基因組DNA。以引物HexC-F/HexA-R擴(kuò)增出約為1900 bp的片段，以引物HexC-F/Tet-R或Tet-F/HexA-R擴(kuò)增出約1500 bp的片段，以引物Tet-F/Tet-R擴(kuò)增出約1190 bp的片段，以引物HexC-IN/HexA-IN未能擴(kuò)增任何片段，表明同源重組可能產(chǎn)生(圖3)。同時(shí)，對(duì)引物HexC-F/HexA-R擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，通過(guò)同源重組從突變株基因組中敲除253 bp的hexC基因下游序列、798 bp的hexB基因全序列和290 bp的hexA基因上游序列。這些結(jié)果表明通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建了C48-3株的hexABC缺失突變株，并命名為C48-3ΔhexABC。

圖2 敲除載體pWSK29△hexABC的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the knockout vector pWSK29△hexABC

圖3 突變株C48-3△hexABC基因組DNA的交叉PCR鑒定Fig.3 Cross-PCR analysis of genomic DNA from mutant C48-3△hexABC

2.5 突變株的RT-PCR鑒定 采用逆轉(zhuǎn)錄酶分別對(duì)突變株和野生株RNA進(jìn)行cDNA合成，并以其為模板，采用針對(duì)目的基因內(nèi)部序列的引物HexCIN/HexA-IN進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)RT-PCR從野生株C48-3中擴(kuò)增出約1300 bp的片段，表明hexABC基因正常轉(zhuǎn)錄；而在突變株C48-3ΔhexABC中為陰性，在轉(zhuǎn)錄水平上表明敲除了hexABC基因(圖4)。

圖4 突變株C48-3△hexABC的RT-PCR鑒定Fig.4 RT-PCR analysis of mutant C48-3△hexABC

2.6 突變株的電鏡觀察 野生株C48-3細(xì)胞壁表面存在較完整的莢膜層，但突變株C48-3ΔhexABC細(xì)胞壁表面未見(jiàn)莢膜結(jié)構(gòu)(圖5)。表明hexABC基因的缺失突變打斷了莢膜透明質(zhì)酸的胞外運(yùn)送，這一結(jié)果也從細(xì)胞水平上證實(shí)敲除了hexABC基因。

圖5 野生株C48-3(A)和突變株C48-3△hexABC(B)的電鏡觀察Fig.5 Electron micrographs of ferritin-stained thin section of P.multocidaC48-3(A)and mutant C48-3△hexABC(B)

2.7 突變株生物學(xué)特性分析 將菌株接種于DSA平板37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察菌落形態(tài)特征。結(jié)果顯示，野生株和突變株在DSA平板上的菌落均為淡灰白色、圓形、邊緣整齊，與野生株相比，突變株長(zhǎng)出非粘性小菌落。革蘭氏染色顯示，野生株和突變株均為陰性，菌體形態(tài)為球桿狀或短桿狀，外觀無(wú)明顯變化。野生株C48-3和突變株C48-3ΔhexABC生長(zhǎng)特性的比較結(jié)果表明兩者生長(zhǎng)速率無(wú)明顯差異，但突變株對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率遲緩，進(jìn)入平臺(tái)期的細(xì)菌密度值比野生株低(圖6)。

圖6 野生株C48-3和突變株C48-3△hexABC的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves ofP.multocidaC48-3 and mutant C48-3△hexABC

2.8 對(duì)小鼠致病性試驗(yàn) 野生株C48-3注射組10只小鼠在感染后第2 d開(kāi)始死亡，至第3 d小鼠全部死亡，剖檢死亡小鼠肝臟、腎臟和肺等主要器官出現(xiàn)不同程度的出血；突變株C48-3ΔhexABC注射組的10只小鼠均未表現(xiàn)任何發(fā)病癥狀，健康狀況良好；陰性對(duì)照組小鼠狀態(tài)均良好。結(jié)果表明莢膜缺陷突變株喪失了對(duì)小鼠的致病性。

3 討論

Chung等采用PSORT軟件預(yù)測(cè)X-73株Hex-ABCD蛋白的分選信號(hào)和分布位置，結(jié)果顯示，HexA蛋白可能是具有ATP結(jié)合功能的莢膜多糖輸出蛋白，HexB蛋白是具有莢膜多糖輸出功能的內(nèi)膜蛋白，而HexC蛋白和HexD蛋白分別為內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，但它們的生物學(xué)功能尚不清楚[5]。Chung等利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建X-73株hexA基因的缺失突變株并檢測(cè)其對(duì)小鼠的致病性，結(jié)果顯示突變株對(duì)小鼠的毒力降低了106倍[9]。

本研究由禽P.multocidaC48-3株基因組中擴(kuò)增出hexABC基因片段，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，結(jié)果顯示被克隆的DNA片段含有hexAB基因的全序列和hexC基因的部分序列，與已發(fā)表的禽P.multocidaX-73株[5]和Pm70株[6]hexABC基因的同源性均為99%，表明hexABC基因在血清型A∶1和A∶3禽P.multocida菌株中具有很高的同源性。為進(jìn)一步研究莢膜的致病性，采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建禽P.multocidaC48-3株hexABC基因的缺失突變株，對(duì)突變株進(jìn)行的PCR、RT-PCR和DNA測(cè)序結(jié)果表明突變株構(gòu)建成功。電鏡觀察結(jié)果顯示，與野生株C48-3和Chung等[9]構(gòu)建的突變株P(guān)BA930相比，突變株C48-3ΔhexABC的菌體表面未見(jiàn)莢膜結(jié)構(gòu)，顯示除hexA基因外，hexBC基因也在莢膜多糖的胞外運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。生物學(xué)特性比較顯示，與野生株相比突變株在DSA平板上長(zhǎng)出非粘性小菌落，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率遲緩，而它們的菌體外觀無(wú)明顯變化。小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，hexABC基因的缺失突變顯著影響禽P.multocidaC48-3株的毒力，即小鼠接種345 cfu的突變株C48-3ΔhexABC時(shí)未能導(dǎo)致小鼠的死亡，而Chung等經(jīng)腹腔注射小鼠1.3×108cfu的hexA基因的缺失突變株P(guān)BA930時(shí)仍未導(dǎo)致小鼠死亡[9]，由此可以推測(cè)本實(shí)驗(yàn)所使用的突變株菌量尚未達(dá)到小鼠死亡的劑量。鑒于雞為血清A∶1禽P.multocida的天然宿主，本實(shí)驗(yàn)還需要通過(guò)SPF雞模型對(duì)hexABC基因做進(jìn)一步研究，以期闡明莢膜在禽P.multocida致病過(guò)程中的作用，為禽P.multocida致病機(jī)理的研究和防治提供參考。

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