李能章，邱榮蓉，黃園媛，鄒靈秀，彭遠(yuǎn)義*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716；2.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，主要侵染豬肺部和淋巴組織中的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[1]。病毒在細(xì)胞中大量復(fù)制組裝，破壞宿主細(xì)胞原有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致這些細(xì)胞功能喪失從而使整個(gè)機(jī)體免疫功能下降[2-3]。不同病毒對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞程度差異決定了感染細(xì)胞最終命運(yùn)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，囊膜病毒的囊膜來源于宿主細(xì)胞的各種膜，但不同病毒形成最終病毒粒子時(shí)獲取囊膜的位置存在差異。PRRSV囊膜來源于宿主細(xì)胞內(nèi)膜成分，但具體來源于細(xì)胞哪部分膜，目前并不清楚。因此，研究病毒獲取囊膜的位置，對(duì)了解該病毒在宿主細(xì)胞中裝配的時(shí)空區(qū)域有著重要意義。本研究選擇PRRSV囊膜蛋白GP5作為一種指示蛋白，通過其在釀酒酵母中的表達(dá)定位來間接反映PRRSV在感染細(xì)胞中獲取囊膜的可能位置。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 含PRRSVgp5基因的pMD-gp5重組質(zhì)粒、E.coliDH5a菌株、釀酒酵母菌株CEN.PK2及定位表達(dá)載體pUG35(帶有g(shù)fp基因)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T Simple載體、BamHⅠ、SalⅠ、ExTaqDNA聚合酶、DNA Ligation Kit ver 2.1購自TaKaRa公司；無氨基酸酵母氮源YNB購自生工生物工程(上海)有限公司；Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil(Y1501)和多種氨基酸購自Sigma公司。

1.2 gp5基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將gp5基因克隆到釀酒酵母表達(dá)載體pUG35中g(shù)fp基因上游位置，構(gòu)建gp5-gfp融合基因重組表達(dá)質(zhì)粒pUG-gp5-gfp，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序驗(yàn)證其正確性。

1.3 基因重組釀酒酵母篩選[4-5]將測序驗(yàn)證正確的pUG-gp5-gfp采用ApaⅠ線性化處理，純化回收后，電擊導(dǎo)入釀酒酵母CEN.pk2細(xì)胞中，涂布于尿嘧啶營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行陽性重組酵母篩選，PCR方法進(jìn)行確證。

1.4 gp5基因在釀酒酵母中表達(dá)的定位檢測[4-5]挑取陽性重組酵母到甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，取誘導(dǎo)培養(yǎng)酵母細(xì)胞熒光顯微鏡觀察，獲取gp5-gfp融合基因在酵母中的表達(dá)和定位信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 PRRSVgp5基因重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的鑒定取PRRSV的gp5基因重組質(zhì)粒pMD-gp5和釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pUG35分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收純化目的片段連接轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選得到酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pUG-gp5-gfp，該重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ酶切鑒定出現(xiàn)一條約600 bp的片段(圖1)，重組表達(dá)質(zhì)粒測序結(jié)果表明： PRRSVgp5基因正確插入到pUG35載體中GFP基因的上游位置，形成融合基因gp5-gfp。gp5基因?yàn)镻RRSV完整ORF5，該基因表達(dá)蛋白具有信號(hào)肽序列，一旦該融合基因在酵母細(xì)胞中獲得表達(dá)，融合蛋白中的GP5部分具有的信號(hào)肽可以引導(dǎo)整個(gè)融合蛋白到相應(yīng)的細(xì)胞位置，而其GFP部分具有熒光性質(zhì)，可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，因此細(xì)胞中觀察到的GFP蛋白熒光強(qiáng)度和位置就反映了GP5蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況和其定位位置。

圖1 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pUG-gp5-gfp的雙酶切鑒定Fig.1 Enzyme digestion analysis of yeast expression plasmid pUG-gp5-gfp

2.2 gp5基因在釀酒酵母中的表達(dá)、定位檢測 對(duì)重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pUG-gp5-gfp和空載質(zhì)粒pUG-gfp分別采用ApaⅠ酶線性化后，電擊導(dǎo)入釀酒酵母CEN.PK2感受態(tài)細(xì)胞中，通過尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得重組酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2和pUG-gfp/CEN.PK2。由于釀酒酵母CEN.PK2為尿嘧啶缺陷型菌株，因此在尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基中生長出來的酵母菌落均為重組酵母，沒有轉(zhuǎn)入目的質(zhì)粒的酵母細(xì)胞在尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上不能生長。

挑取重組酵母接種到甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，30℃220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，取培養(yǎng)物直接進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示：表達(dá)GP5-GFP蛋白時(shí)，綠色熒光集中分布的位置與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的定位模式相一致(圖2a-c)[6]，而單獨(dú)表達(dá)GFP蛋白時(shí)，綠色熒光均勻分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，無特定的定位位置(圖2d-f)。該結(jié)果表明gp5基因在釀酒酵母中獲得了表達(dá)，所表達(dá)蛋白能夠定位到細(xì)胞的內(nèi)膜上，其定位內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的特性間接反映了PRRSV在宿主細(xì)胞中最終獲取囊膜的位置，進(jìn)而印證了PRRSV在未破裂的感染細(xì)胞中存在有完整病毒粒子[7]。同時(shí)這種定位研究模式可以為其他病毒的各個(gè)成分在宿主細(xì)胞中的組裝位置研究提供新的思路，進(jìn)而為提出新的病毒控制方法。

gp5基因誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)顯示，所篩選的重組酵母在4℃處理7 d以上或通過兩次-80℃凍存后，重新活化的酵母菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后熒光顯微鏡觀察，其熒光強(qiáng)度要比不經(jīng)處理的酵母菌熒光強(qiáng)度大；同時(shí)，初始接種量及誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間長短對(duì)融合熒光蛋白表達(dá)也有非常大的影響，初始接入酵母細(xì)胞后的液體培養(yǎng)基OD600nm值為0.6～0.8，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h時(shí)進(jìn)行熒光觀察最好，這時(shí)，具有熒光的酵母細(xì)胞多，熒光較強(qiáng)，而增加誘導(dǎo)時(shí)間，則具有熒光的酵母細(xì)胞減少，熒光強(qiáng)度減弱。

圖2 gp5-gfp融合基因在釀酒酵母中的表達(dá)及融合蛋白在細(xì)胞中的定位Fig.2 Expression and cell localization of GP5 protein fusion with GFP in the Saccharomyces cerevisiae detected by fluorescence microscope

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