劉 陽，孔繁德，徐淑菲，吳德峰，林 立

(1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 廈門 361026；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，VA)均屬于弧菌科弧菌屬，是通過食物、水傳播的病原菌。VP和VA具有相似的生物學(xué)特性和同樣的致病性，是引起腹瀉和食物中毒的重要病原菌。

據(jù)報(bào)道VP的危害僅次于沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。我國沿海地區(qū)每年都有因VP引起食物中毒的報(bào)道[1-2]。VA是海產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌種，近年來VA引起急性腹瀉和食物中毒的病例日益增多。VA廣泛分布于自然界，是海洋生物弧菌病中危害最大的病原菌之一，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界各國食品衛(wèi)生法規(guī)中均將該菌列入法定檢測項(xiàng)目，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)禁止進(jìn)口和出口[3-5]。為有效控制這兩種病原的發(fā)生和擴(kuò)散，準(zhǔn)確即時(shí)的檢測手段是預(yù)防該病及控制病原菌傳播的關(guān)鍵。本研究利用雙重PCR技術(shù)，參照GenBank中登錄的VP和VA的toxR基因序列，設(shè)計(jì)兩對針對VP和VA的特異性引物，建立同時(shí)快速檢測這兩種細(xì)菌的PCR方法，進(jìn)一步完善這兩種細(xì)菌的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 VP(編號1.2164)購自中國普通微生物保藏管理中心；VA(編號266)、霍亂弧菌(編號312)、麥?zhǔn)匣【?編號452)、沙門氏菌(編號豬肝27)、美人魚弧菌(編號569)各一株，均由廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存。

1.2 主要試劑 細(xì)菌DNA提取試劑盒和PCR反應(yīng)試劑盒均購自TaKaRa公司；DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中登錄的VP和VA的toxR基因序列，應(yīng)用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)兩對特異性引物，VP和VA PCR擴(kuò)增片段大小分別為208 bp和159 bp，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。VP(ToxR)F1：5'-CGAAAGCCGTAT ACTCCTGATG-3'；VP(ToxR)R1：5'-GAGTTGATAG CCTCGTTTTGGA-3'； VA(ToxR)F1： 5'-GATCGTTT TGACCTGCGAAA-3'； VA(ToxR)R1： 5'-GCATTGA GCGCTACGTGAA-3'。

1.4 雙重PCR一步法同時(shí)檢測VP和VA方法的建立[6]將VP和VA菌株分別接種到3.5%堿性蛋白胨水中，過夜培養(yǎng)18 h～24 h，按試劑盒說明提取菌體DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，50 umol/L兩種細(xì)菌的上下游引物各 0.3 μL， 0.5 u/μLTaqDNA 聚合酶 2 μL，ddH2O 11.3 μL，兩種細(xì)菌的DNA模板各1 μL。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 45 s、53℃ 45 s、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 最佳反應(yīng)條件的測定 分別利用兩對引物進(jìn)行兩種細(xì)菌雙重PCR方法最佳退火溫度、引物濃度、dNTP濃度、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶濃度等的測定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行雙重PCR方法最佳循環(huán)次數(shù)的測定。

1.6 靈敏度檢測 取37℃培養(yǎng)18 h～24 h的VP和VA菌液做10倍梯度稀釋至10-6，各稀釋度菌液參照國標(biāo)法(GB/T 4789.2-2003)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出每毫升細(xì)菌原液所含的細(xì)菌數(shù)量。采用試劑盒分別提取已經(jīng)計(jì)數(shù)的VP和VA的細(xì)菌原液(各1 mL)的核酸，將提取的DNA模板做10倍梯度稀釋，稀釋至10-6，采用優(yōu)化好的PCR體系進(jìn)行靈敏度的檢測。

1.7 特異性測定 分別提取VP、VA、霍亂弧菌、麥?zhǔn)匣【?、沙門氏菌、美人魚弧菌等DNA，利用所選擇的最佳條件分別進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，以檢測其特異性。

1.8 穩(wěn)定性測定 按照以上優(yōu)化條件將除模板以外的PCR反應(yīng)體系中的試劑混合后分裝制成檢測試劑盒，于-20℃凍存，每隔1個(gè)月取出兩管按照最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測其穩(wěn)定性。

1.9 人工污染試驗(yàn) 將不含有VP和VA的冷凍帶魚攪碎，無菌條件下分裝到3.5%堿性蛋白胨水中數(shù)管，將已經(jīng)做好細(xì)菌計(jì)數(shù)的VP和VA按不同細(xì)菌數(shù)量分別接種到裝有帶魚的3.5%堿性蛋白胨水中，培養(yǎng)18 h～24 h，分別進(jìn)行雙重PCR檢測和傳統(tǒng)方法檢測。

1.10 臨床檢測 進(jìn)口冷凍帶魚、魷魚和墨魚，活甲魚、甲魚蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，采用雙重PCR技術(shù)檢測，同時(shí)與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)條件的確定 經(jīng)測定反應(yīng)體系的最佳退火溫度為53℃。最佳反應(yīng)體系為25 μL：VP和VA的上下游引物(50 umol/L)0.3 μL；MgCl2(25 mmol/L)4 μL；dNTP(2.5 mmol/L)2 μL；TaqDNA 聚合酶(0.5 U/μL)2 μL。最佳循環(huán)次數(shù)為 30 個(gè)～35 個(gè)(圖 1)。

2.2 靈敏度的測定 經(jīng)過細(xì)菌計(jì)數(shù)，確定每毫升溶液中VP和VA的濃度分別為2.32×108cfu/mL和2.56×108cfu/mL，將提取的細(xì)菌核酸進(jìn)行10倍系列稀釋，采用單一PCR和雙重PCR同時(shí)檢測，結(jié)果顯示該雙重PCR檢測VP和VA靈敏度分別為2.32×103cfu/mL 和 2.56×103cfu/mL(圖 2～圖 4)，并且靈敏度的數(shù)量級和單一PCR相同，表明該方法的靈敏度較高。

圖1 最佳循環(huán)次數(shù)的測定Fig.1 Optimization of the cycle numbers in duplex PCR

圖2 雙重PCR靈敏度的測定Figs.2 The sensitivity detection of VP and VA by duplex PCR

圖3 VP單一PCR靈敏度的測定Figs.3 The sensitivity detection of VP by single PCR

2.3 特異性測定 結(jié)果顯示無論單一PCR還是雙重PCR，均只有目標(biāo)細(xì)菌擴(kuò)增出目的片段，而其它細(xì)菌和陰性對照均未擴(kuò)增出目的片段(圖5～圖7)。表明本研究建立的檢測方法特異性好。

2.4 穩(wěn)定性測定 檢測期間將預(yù)先混合的PCR檢測試劑盒放置-20℃條件下保存，連續(xù)檢測12個(gè)月仍能擴(kuò)增出清晰的目的條帶，表明本檢測試劑盒的穩(wěn)定性較好。

圖4 VA單一PCR靈敏度的測定Fig.4 The sensitivity detection of VA by single PCR

圖5 雙重PCR特異性的測定Figs.5 The specificity detection of VP and VA by duplex PCR

圖6 VP單一PCR特異性的測定Fig.6 The specificity detection of VP by single PCR

圖7 VA單一PCR特異性的測定Fig.7 The specificity detection of VA by single PCR

2.5 人工污染樣品檢測試驗(yàn) 試驗(yàn)表明檢測樣品中只要含有2 cfu VP或3 cfu VA，經(jīng)增菌后均能通過雙重PCR方法同時(shí)檢出，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測方法檢測結(jié)果完全符合。

2.6 臨床檢測 采用雙重PCR同時(shí)檢測進(jìn)口冷凍帶魚、魷魚和墨魚，活甲魚、甲魚蛋、螃蟹和蝦等100份樣品，結(jié)果從進(jìn)口甲魚中檢出2份VP陽性和3份VA陽性，從進(jìn)口螃蟹中檢出1份VP陽性和2份VA陽性，檢測結(jié)果與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果完全符合，但檢測時(shí)間從常規(guī)檢測時(shí)間4 d至少縮短2 d，加快了檢測進(jìn)程。

3 討論

本研究建立的雙重PCR方法，可以同時(shí)檢測VP和VA兩種病原，并且從制樣到得出明確的檢測結(jié)果只需1.5 d，每個(gè)PCR反應(yīng)成本不到1元。本研究所提供的方法對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求較低，普通的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室均可以進(jìn)行，無需購買特殊設(shè)備和試劑，操作簡單，只需在混合好的PCR反應(yīng)體系中加入提取的菌體DNA模板即可用于PCR反應(yīng)，縮短了檢測時(shí)間，能夠滿足應(yīng)緊急情況下的快速應(yīng)急機(jī)制的要求。

該方法設(shè)計(jì)的引物是參照GenBank中登錄的VP和VA的toxR基因序列而設(shè)計(jì)，toxR基因是廣泛存在于弧菌中的和毒力相關(guān)的調(diào)節(jié)基因，該基因序列具有高度保守性，其編碼的蛋白具有一個(gè)高度變異的膜結(jié)合區(qū)，目前發(fā)現(xiàn)該基因只存在于弧菌科中。因此該基因被廣泛用于弧菌的鑒定。

本研究針對所選toxR基因，對雙重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的雙重PCR方法能夠使兩個(gè)目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物均達(dá)到最高的擴(kuò)增效率，并且避免了非特異性條帶的擴(kuò)增，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性[7]。王華麗等對海產(chǎn)品中的VP采用PCR檢測toxR基因，檢測靈敏度為42 cfu[8]。張新中等采用建立的雙重PCR方法對海產(chǎn)品中VP檢測靈敏度為140 cfu[9]。韓一凡等根據(jù)VA的toxR基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測，靈敏度達(dá)到3.7×103cfu/mL[10]。汪笑宇等根據(jù)VA的gyrB基因序列的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測，靈敏度達(dá)103cfu/mL[11]。本研究對VP和VA檢測敏感度分別為2.32×103cfu/mL和2.56×103cfu/mL，與以往研究結(jié)果接近甚至更好，表明該方法具有較好的檢測靈敏度。本實(shí)驗(yàn)的檢測靈敏度等于致病菌的感染劑量，因此該方法適合用于VP和VA的早期檢測。該方法對于控制和消滅這兩種細(xì)菌和加強(qiáng)口岸檢疫都必將發(fā)揮重要作用。

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