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廣西豬星狀病毒分子流行病學調查

2012-05-21 04:36蘭家暖張民秀盧冰霞黃福標覃熊慧黃偉堅
中國預防獸醫(yī)學報 2012年8期
關鍵詞:亞群豬群日齡

蘭家暖,劉 磊,郭 旋,張民秀,盧冰霞,黃福標,覃熊慧,張 寧,黃偉堅*

(1.廣西大學 動物科學技術學院,廣西 南寧 530005;2.廣西柯新源(集團)原種豬有限責任公司,廣西 南寧 530001;3.橫縣石塘鎮(zhèn)水產畜牧獸醫(yī)站,廣西 橫縣 530311;4.廣西農墾永新畜牧集團金光有限公司,廣西 南寧 530042)

星狀病毒(Astrovirus,AstV)是一種人畜共患病病原,廣泛分布于世界各地,除人以外還能夠感染豬、牛、貓、水貂、鼠、雞、鴨、獵豹、狗、蝙蝠和海豚等多種動物[1-2]。AstV感染人和其它哺乳動物主要引起腸道病毒性腹瀉和嘔吐,在禽除引起腸道疾病外還引起腎炎及致命性肝炎等疾病[3-4]。

豬星狀病毒(PAstV)為1980年由Bridger等用電鏡檢測斷奶3周齡豬腹瀉糞便時發(fā)現(xiàn),其所引起的疾病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的疫病之一[1]。許多國家對PAstV流行病學的報道顯示,豬群中存在PAstV高感染率和高血清陽性率[5-6]。然而,該病在我國一直未受到重視,除商曉桂等對上海周邊豬群進行PAstV調查之外[7],未見有其它相關報道。鑒于其流行性和危害性,亟需對其深入研究。

本研究采用RT-套式PCR(RT-nPCR)技術,對廣西豬場進行PAstV分子流行病學調查及基因型分析,明確PAstV在豬群中的流行情況,對豬場防制該病具有重要意義,對預防人獸共患AstV感染也具有重要的公共衛(wèi)生學意義。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和處理 2008年12月~2010年12月,從廣西7個市縣29個不同規(guī)模豬場采集不同階段豬腹瀉糞便共315份(表1、表2和表3),以PBS稀釋成10%的懸液,3000 r/min,4℃離心10 min,取上清液用于病毒RNA的提取。

1.2 載體和受體菌 pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室制備保存。

1.3 主要試劑 TRIzol、dNTPs、Biospin膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒均購自上海生物工程技術服務有限公司;TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、內切酶HindⅢ和BamHⅠ購自Fermentas公司;M-MLV反轉錄酶(200 U/μL)購自Promega公司。

1.4 引物設計 參照文獻[8]針對PAstV ORF25'端保守區(qū)合成兩對引物進行RT-nPCR擴增,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5 RT-nPCR 按照TRIzol法抽提糞便處理液中病毒RNA,以AST665R作為反向引物反轉錄獲得病毒cDNA;PCR反應參照文獻[8]進行。

1.6 PCR產物的克隆 采用膠回收試劑盒對目的PCR產物進行回收,與pMD18-T連接;轉化DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性克隆,提取重組質粒。

1.7 基因測序與樣品統(tǒng)計分析 鑒定為陽性的重組質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司測序;采用統(tǒng)計學軟件對不同階段豬群、不同地點、不同季節(jié)PAstV感染情況進行統(tǒng)計分析。

1.8 序列比對及基因型分析 測定的序列以Laserge ne DNAStar 7.1軟件包進行比對分析,MEGA 5.0 beta軟件Neibor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。本研究的參照序列為:PAstV-1(Y15938)、PAstV-1(AB037272)、PAstV(HM756258)、PAst V-2(GU562296)、PAstV(HM756259)、PAstV(HM756260)和PAstV(HM756261)。

2 結果

2.1 RT-nPCR檢測結果 采用RT-nPCR方法,從豬腹瀉糞便樣品中擴增得到約180 bp的片段,與預期(183 bp)相符,初步證實豬群中存在PAstV感染(圖 1)。

圖1 RT-nPCR檢測結果Fig.1 Defection of PAstV by RT-nPCR

2.2 廣西PAstV流行情況 對廣西7個市縣共29個不同規(guī)模化豬場進行PAstV檢測,結果顯示豬場陽性率達82.8%(24/29),共檢測315份豬腹瀉糞便樣品,其中27份為陽性,陽性率達40.3%(表1)。

2.3 豬群不同日齡感染調查情況 對不同日齡豬群感染率進行調查,結果顯示1日齡~30日齡陽性率最高(表 2)。

表1 廣西各地豬場PAstV樣品來源及檢測結果Table1 Origins of Guangxi PAstV Fecal samples and results

續(xù)表1

表2 豬群不同日齡感染率情況Table 2 Infection rate of pigs at different ages

2.4 豬群不同季節(jié)感染情況 從2008年12月~2010年12月,分4個季節(jié)進行分析。結果顯示PAstV春季感染率最高(表3)。

表3 豬群不同季節(jié)感染率情況Table 3 Infection rate of pigs in different Seasons

2.5 同源性比較 將鑒定為陽性的樣品進行克隆和測序,獲得46株PAstVs。同源性分析顯示,46株PAstV之間核苷酸同源性為84.6%~100%,氨基酸序列同源性為51.1%~100%;克隆獲得的46株PAstVs與PAstV參考株核苷酸序列同源性為45.1%~92.3%,氨基酸同源性為12.5%~81.2%。

2.6 基因型分析 采用MEGA 5.0 beta軟件將46株PAstVs與GenBank中登錄的7株PAstVs參考株構建進化樹,結果顯示本研究獲得的46株PAstVs與參考株PAstV(Y15938)、PAstV(AB037272)、PAstV(HM756258)構成一大簇,均為PAstV-1型。根據(jù)Ulloa等[9]分型方法,可以將46株PAstVs分為a、b、c、d和 e共 5個亞群(圖 2)。

另外,將獲得的46株PAstVs與7株PAstVs參考株的ORF2編碼的氨基酸序列進行多序列比對,根據(jù)各亞群特有的氨基酸也可以將46株分為5個亞群。a亞群在28A/E和38Y/H;b亞群在25F/L、26T/I;c亞群在37V/I、38Y/H、42W/R、43A/T、44K/E;d亞群在9H/Y、32V/L、42W/R;e亞群在2P/S、22G/S、26T/A和29D/H存在氨基酸替換。

圖2 進化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on ORF2 sequences

3 討論

PAstV可以引起爆發(fā)性或散發(fā)性豬胃腸炎,尤其對哺乳期仔豬影響較大,嚴重者可以引起脫水和死亡[4]。本研究2008年12月~2010年12月,從廣西7個市縣29個不同規(guī)模化豬場共采集不同階段豬腹瀉糞樣315份,采用RT-nPCR方法對PAstV進行檢測,經克隆和測序最終證實廣西豬群中存在PAstV感染。

人源AstV(HAstV)感染存在明顯的季節(jié)性,而PAstV的流行季節(jié)目前還不清楚。本研究結果顯示,PAstV感染主要發(fā)生在春季和冬季,流行主要在11月份~次年4月份,即感染主要發(fā)生在天氣寒冷及氣溫多變的季節(jié)。春季及冬季PAstV感染多發(fā)的原因可能是由于冬季天氣寒冷,豬場保溫措施及污物處理不當;而春季天氣變化較大,對豬的應激最大,豬群免疫機能下降時最容易被感染。另外,在研究PAstV的過程中,我們也對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PRV)進行檢測,其中PEDV陽性率為27.2%,PRV陽性率為25.6%,TGEV陽性率為7.2%,3種常見腹瀉病原的檢出率都明顯比PAstV檢出率低。本研究結合近幾年來哺乳豬及斷奶豬在天氣寒冷時出現(xiàn)腹瀉及死亡率高的狀況進行調查,為豬場有效防控該病、減少養(yǎng)豬業(yè)的損失提供參考。

有關研究顯示,HAstV主要感染5歲以下兒童[9],而本研究證實PAstV主要感染斷奶前仔豬,這與Luo等報道相似[6];另外,本研究在正常豬糞便樣品中檢測出PAstV,表明有些豬感染PAstV后并不表現(xiàn)出臨床癥狀,但可以作為PAstV的儲存宿主及持續(xù)傳染源而感染其它動物或人[6]。

本研究擴增獲得的46條PAstVs序列均屬于PAstV-1型,又可以分為5個亞群。相關研究表明,同種動物可能受到多個亞群PAstV感染及AstV可以跨過種間屏障傳播和垂直感染[10]。本研究顯示,某些采自不同時間、不同地點和不同日齡豬群的PAstV核苷酸相似性很高,甚至達100%,表明病毒株感染豬沒有一定的日齡限制,同一亞群病毒株可以感染不同日齡的豬群,而這可能是由于豬場在引種時已感染該病原,或是被感染的仔豬從發(fā)病場出售到其它場時該病原得到傳播;另外,某些采自同一時間、同一地點的同源性較低,表明即使在同一個豬場可能同時存在幾個亞群病毒株流行,這可能是由于其從不同豬場引種而帶來不同病毒株。

本研究表明PAstV在廣西地區(qū)豬群中已存在,有必要進行深入的研究,以全面了解該病毒的流行病學和生物學特性,從而評估該病毒在仔豬尤其是斷奶前仔豬的腹瀉中所起的作用。

[1]Bridger J C.Detection by electron microscopy of caliciviruses,astroviruses and rotavirus-like particles in the faeces of piglets with diarrhoea[J].Vet Rec,1980,107(23):532-533.

[2]Rivera R,Nollens H H,Venn-Watson S,et al.Characterization of phylogenetically diverse astroviruses of marine mammals[J].J Gen Virol,2010,91(1):166-173.

[3]Mendez E,Aguirre-Crespo G,Zavala G,et al.Association of the astrovirus structural protein VP90 with membranes plays a role in virus morphogenesis[J].J Virol,2007,81(19):10649-10658.

[4]Knipe D M,Howley P M.Fields Virology[M].5th Edition,2007.

[5]Shimizu M,Shirai J,Narita M,et al.Cytopathic astrovirus isolated from porcine acute gastroenteritis in an established cell line derived from porcine embryonic kidney[J].J Clin Micro biol,1990,28(2):201-206.

[6]Luo Zhi-yao,Roi S,Dastor M,et al.Multiple novel and prevalent astroviruses in pigs[J].Vet Microbiol,2011,149:316-323.

[7]商曉桂.豬星狀病毒的分離鑒定和熒光定量PCR檢測方法的建立[D].內蒙古農業(yè)大學,2010.

[8]Indik S,Valicek L,Smid B,et al.Isolation and partial characterization of a novel porcine astrovirus[J].Vet Microbiol,2006,117(2-4):276-283.

[9]Liu Man-qing,Yang Bei-fang,Peng Jin-song,et al.Molecular epidemiology of astrovirus infection in infants in Wuhan,China[J].J Clin Microbiol,2007,45(4):1308-1309.

[10]Zhu Hua-chen,Chu D K W,Liu Wei,et al.Detection of diverse astroviruses from bats in China[J].J Gen Virol,2009,90(4):883-887.

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