白 靜, 王一茹, 劉麗鳳, 陳 杰, 蘇紹萍, 王 禹

（1解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 北京 100048; 解放軍總醫(yī)院: 老年心血管病研究所2, 第九診室3, 北京 100853）

心肌細胞的再生能力極其有限, 當大面積心肌梗死后造成大量細胞丟失, 幾乎不可避免地發(fā)生心力衰竭。因此, 缺血性心臟病已經(jīng)成為全球最主要的致死性疾病之一[1]。以細胞移植為基礎的再生性治療可以避免目前的藥物治療、器械輔助支持治療以及心臟移植等的不足, 成為修復受損心肌的一種理想治療方法。近20年來的研究顯示, 多種來源的干細胞, 由于具有自我更新及多潛能分化能力, 顯示了一定的再生性治療的潛力。然而, 成體干細胞取材困難、成體組織干細胞含量低且細胞在體外增殖周期長等問題, 限制了臨床應用。另一方面, 胚胎干細胞由于致瘤性及倫理學爭議也受到限制。因此,需要一種新型的干細胞, 避免以上所有局限性。羊水中蘊含多種由發(fā)育中的胎兒的消化道、呼吸道、泌尿道以及胎膜脫落的細胞。常規(guī)的產(chǎn)前診斷就是通過羊膜腔穿刺技術(shù)獲取少量羊水, 在體外培養(yǎng)羊水細胞, 進行核型分析來進行的。已經(jīng)有研究顯示,羊水中除存在大量不同來源的干細胞外, 還存在相當數(shù)量的祖細胞。2007年, De Coppi等[2]通過免疫磁珠從羊水中分選得到CD117+（c-kit）干細胞（接近羊水細胞的1%）, 發(fā)現(xiàn)這些細胞可以在體外迅速增殖, 且傳代250代后核型穩(wěn)定。細胞表達間充質(zhì)干細胞標記物（Oct-4）及胚胎干細胞標記物（SSEA-4）。許多學者認為c-kit+羊水干細胞處于成體干細胞及胚胎干細胞的中間階段, 是一種新型干細胞來源, 并且其分化能力也優(yōu)于所有成體干細胞。Da Sacco等[3]報道, 羊水中的細胞組成存在明顯的“時限性”: 即不同孕周期, 細胞的組成不同。該研究提示, 可能c-kit+羊水干細胞在孕期中存在一定的表達規(guī)律。本研究旨在比較孕中期c-kit+與c-kit-羊水干細胞的生物學特征及心肌細胞分化能力, 并進一步評價c-kit+的心肌再生性治療的潛能。

1 材料與方法

1.1 樣本及羊水細胞

通過產(chǎn)前診斷或自愿引產(chǎn), 經(jīng)羊膜腔穿刺技術(shù)獲取14份孕中期（15～31周）羊水。該操作獲得解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。均征得孕婦本人及家屬同意并簽署知情同意書。研究中的羊水細胞均已證實無核型異常。

1.2 羊水細胞的體外分離、培養(yǎng)及分選

超聲引導下, 行羊膜腔穿刺術(shù)抽取無菌羊水各10ml。羊水標本移入4℃冰箱運送至實驗室, 4h內(nèi)進行離心, 室溫下1500r/min, 5min。棄上清, 將沉淀用α-MEM培養(yǎng)基（Gibico）重懸后加入20%胎牛血清（Gibico）, 18% Chang Medium B+2% Chang Medium C（Irvine Scientific）, 1%青鏈霉素, 1%谷氨酰胺（Gibico）。接種至25cm2培養(yǎng)瓶中, 37℃, 5% CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。培養(yǎng)3～7d后, 非貼壁細胞及雜質(zhì)被去除, 貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)。以倒置相差顯微鏡（Olympus IX51）觀察細胞形態(tài)。待細胞生長至80%融合后以0.25% 胰蛋白酶和1mmol/L EDTA（Invitrogen）消化和傳代。取羊水貼壁細胞, 使用單克隆鼠抗人抗c-kit（CD117）抗體, 經(jīng)流式細胞儀分選。將分選的c-kit+細胞接種至培養(yǎng)皿, 以原方法繼續(xù)培養(yǎng)并傳代。

1.3 羊水細胞生長曲線

分別取第5, 10代c-kit+及c-kit-羊水細胞, 消化并接種至96孔板。每孔加入100ul, 約3000個細胞,并設無細胞的對照孔。 5% CO2, 37℃孵育過夜, 至細胞單層鋪滿孔。每孔加入20μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)3～4h。在酶聯(lián)免疫檢測儀[enzyme micro-plate reader（Bio-Rad）]490nm處測量各孔的吸光值（A490nm）。每天取3個孔檢測, 計算平均值, 連續(xù)觀察8d, 繪制生長曲線。

1.4 流式細胞儀分析

取擴增第5～7代的c-kit+及c-kit-羊水細胞進行細胞表型鑒定。細胞用0.125%胰蛋白酶消化, 血清終止消化后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS; Sigma-Aldrich)洗滌、重懸, 調(diào)整細胞濃度為5×105/ml 單細胞懸液, 每管1ml, 共取8管, 分別加入鼠抗人單克隆抗體PE-CD29、PE-CD44、PE-CD73、PE-CD90、PE-CD105、PE-CD45、PECD34、PE-HLA- DR、PE-HLA-ABC, 兔抗人單克隆抗體抗 PE-Oct-4（BD公司）各20μl充分混勻, 避光室溫孵育30 min, PBS洗2遍（1500r/min, 離心5 min）,重新制成細胞懸液0.5 ml, 流式細胞儀（Cytomics FC 500 MPL BECKMAN COWLER）檢測。數(shù)據(jù)表達為細胞數(shù)量/106細胞計數(shù)單位。

1.5 免疫細胞化學分析

取第5～7代c-kit+及c-kit-羊水細胞進行細胞免疫化學染色。4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min, 分別滴加 1:100鼠抗人單克隆抗體（抗 Oct-4、抗SSEA-4、抗 CD29、抗 CD34、抗 CD44、抗 CD45、抗CD73、抗CD90、抗CD105; BD公司）, 同時滴加PBS組為陰性對照, 4℃過夜, 滴加FITC-羊抗鼠第二抗體IgG（Invitrogen）, 室溫下孵育20 min, 鏡下觀察結(jié)果。陰性對照不加一抗。共聚焦顯微鏡（Olympus fluoview fv1000）留取影像資料。

1.6 成脂、成骨細胞誘導分化

通過成脂及成骨細胞分化來評估c-kit+及 c-kit-羊水細胞的間充質(zhì)分化能力。細胞以3000/cm2的密度接種在培養(yǎng)皿, 以 DMEM 低糖培養(yǎng)基+15%FBS+1%青鏈霉素（Gibco）, 成脂細胞誘導液（1μmol/L 地塞米松, 1 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤,10 g/mL 胰島素, 60 μmol/L 吲哚美辛; Sigma）誘導21d, 油紅 O染色觀察脂滴形成, 通過 RT-PCR儀（BIO RADC1000）檢測脂連素基因的表達。以DMEM低糖培養(yǎng)基+10% FBS+1%青鏈霉素(Gibco),成骨細胞誘導液（100 nmol/L 地塞米松, 10 mmol/L β-甘油磷酸鹽, 0.05 mmol/L 抗壞血酸2-磷酸鹽）誘導21d, Von Kossa染色后觀察深棕褐色鈣沉積顆粒。并通過RT-PCR檢測骨橋蛋白的基因表達。RT-PCR引物及產(chǎn)物大小見表1。

表1 RT-PC引物及產(chǎn)物大小Table 1 The primers for RT-PCR and the product size

1.7 心肌樣細胞誘導分化

將第5代c-kit+與c-kit-羊水細胞分別與新生乳鼠心肌共培養(yǎng), 使用 transwell板, 可以允許培養(yǎng)基相同, 卻阻止兩種細胞相互接觸。羊水細胞與乳鼠心肌細胞混合比例為1:10。培養(yǎng)皿細胞以3000個/cm2密度接種。用 DMEM 低糖培養(yǎng)基+10%馬血清（Gibico）+ 0.5%雞胚提取物（Gibico）+1%青鏈霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng) 10d。提取總 RNA, 通過 RT-PCR檢測誘導后心肌細胞特異標志基因GATA4、α-actin、Cx43和cTnT的mRNA表達。引物序列見表1。未誘導的細胞設為對照。進一步進行 Western blot分析。一抗使用羊抗人抗體（抗-GATA-4, 抗-cTnT, 抗-α-actin和抗-Cx43）, 二抗為兔抗羊抗體（Zymed Laboratories, Inc. South San Francisco, CA）, 蛋白電泳, 轉(zhuǎn)移裝置（BIO-RAD）。

1.8 統(tǒng)計學處理

使用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理（SPSS Inc. Chicago, IL, USA）。計量資料以均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 誘導前羊水細胞形態(tài)、生長曲線

共14份羊水標本（孕15～31周）用于分析。新獲得的羊水細胞在培養(yǎng)瓶中呈懸浮狀態(tài)。細胞形態(tài)為多樣性, 不規(guī)則形。培養(yǎng)3～7d后, 出現(xiàn)貼壁細胞,原代細胞成島狀或成簇生長, 細胞為長紡錘形或上皮樣形態(tài)。經(jīng)過c-kit分選, c-kit+羊水細胞為均勻一致的成纖維狀（圖1A）。共有5份羊水分選到c-kit+細胞, 來源于16～22周羊水。C-kit+細胞數(shù)量約占貼壁細胞的（3.30±1.24）%。成纖維細胞在體外可以傳代至50代以上。來源于孕15周羊水的細胞（樣本A）, 由于細胞數(shù)量極少, 未能傳代。有3份標本來自孕中期較晚階段（樣本M,S,T）主要表現(xiàn)為上皮樣細胞, 在體外傳代不超過5代（圖2）。MTT法檢測細胞增殖, 可以看到第5, 10代c-kit+及c-kit-羊水細胞具有相似的生長曲線（圖1 B）。

2.2 流式細胞儀及免疫細胞化學分析

流式細胞儀及免疫細胞化學分析顯示, c-kit+羊水細胞表達間充質(zhì)干細胞表面標記CD29, CD44,CD73, CD90, CD105; 不表達造血細胞系標記CD34,CD45; 表達HLA-ABC（I型主要組織相容性抗原,MHC-I）; 不表達HLA-DR（Ⅱ型主要組織相容性抗原, MHC-Ⅱ）; 部分表達Oct-4和SSEA-4。C-kit-羊水細胞也表達如上述間充質(zhì)干細胞標記; 不表達造血細胞系標記; 表達MHC-I（HLA-ABC）; 不表達MHC-Ⅱ(HLA-DR); 不表達Oct-4和SSEA-4（圖3,圖4）。

圖1 c-kit+和c-kit-羊水干細胞的形態(tài)及生長曲線Figure 1 Morphological characteristics and growth curves of amniotic fluid-derived c-kit+ and c-kit- stem cells

圖2 流式細胞儀分析及Oct-4的免疫細胞化學分析Figure 2 Flow cytometry analyseis and immunocytochemical staining of Oct-4 positive cells

圖3 羊水細胞的形態(tài)、增殖及表型鑒定Figure 3 Morphology, proliferation, flow cytometry for stem cells markers in human amniotic fluid-derived cells

圖4 免疫細胞化學分析Figure 4 Immunocytochemical analysis (×200)

2.3 成骨細胞誘導分化

成骨細胞誘導后可見深褐色鈣沉積顆粒,RT-PCR分析顯示表達骨橋蛋白mRNA。成脂細胞誘導后, 在細胞內(nèi)可以觀察到脂滴形成, RT-PCR分析顯示表達脂連素mRNA（圖5）。

圖5 c-kit+和c-kit-羊水干細胞的成脂和成骨分化Figure 5 Adipogenic and osteogenic differentiation of c-kit+(a, c) and c-kit-(b, d) AFS cells (×200)

2.4 心肌樣細胞誘導分化

通過與乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)的方式誘導羊水c-kit+及c-kit-干細胞向心肌樣細胞分化。RT-PCR 和Western blot 分析顯示: 心肌細胞相關(guān)基因和蛋白（GATA-4, cTnT, α-actin, Cx43）表達陽性。然而,c-kit-羊水干細胞經(jīng)誘導后僅檢測到GATA-4的基因及蛋白陽性（圖6）。

3 討 論

圖6 心肌相關(guān)基因的RT-PCR和Western blot分析Figure 6 RT-PCR and Western blot analysis of myocardiumrelated genes

羊膜腔穿刺術(shù)通常在孕中期完成, 因為此期的羊水中蘊含大量胎兒脫落的細胞, 可以用于產(chǎn)前診斷。當細胞數(shù)量超過5000個/ml時, 就要考慮可能存在胎兒畸形。本研究中, 獲得的羊水從孕15～31周,羊水細胞的數(shù)量平均100～2500個/ml。原代培養(yǎng)的羊水細胞, 貼壁后表現(xiàn)為成纖維樣或成上皮樣。細胞平均貼壁時間為（5.12±1.87）d。傳代3～4代后,大部分細胞為成纖維狀, 上皮樣細胞逐漸減少。成纖維狀細胞可以在體外傳代至50代以上。本研究中發(fā)現(xiàn), 3份標本細胞形態(tài)均以上皮樣為主, 在體外傳代不超過5代, 提示這種細胞并非干細胞。這3份標本分別來自孕26, 30及32周, 提示隨著孕周增加,成體細胞的比例可能更高。我們發(fā)現(xiàn), 16～24周的羊水較易培養(yǎng)出成纖維樣細胞。既往研究認為這種成纖維狀的貼壁生長的細胞為間充質(zhì)干細胞。然而,羊水中的細胞成分復雜, 蘊含多種來源的干細胞或祖細胞, 如果用于臨床, 需要篩選出一組純化的細胞群。通過細胞表面抗原分選是一種簡單、高效的分選方法。C-kit是一種受體蛋白, 通常在胚胎干細胞及原始胚層細胞中表達[4]。C-kit+細胞是新近發(fā)現(xiàn)的羊水中的間充質(zhì)干細胞亞型, 目前并不明確它的確切來源及在胎兒發(fā)育中的作用。一些研究已經(jīng)顯示了c-kit+羊水細胞的臨床應用潛力[5]。Arnhold等[6]的研究發(fā)現(xiàn), 羊水細胞的組成在孕期中存在明顯的“時限性”, c-kit+細胞在孕17～18周增加, 孕19周后消失。我們通過流式細胞儀分選c-kit+細胞, 發(fā)現(xiàn)c-kit+細胞分布在孕16～22周。這種偏差可能由于樣本誤差。在體外培養(yǎng), 我們發(fā)現(xiàn)第5代及第10代的c-kit+及c-kit-羊水干細胞具有相似的生長曲線。c-kit+羊水干細胞占羊水貼壁細胞的（3.30±1.24）%, 與文獻報道的1%～5%相似[2,6], 提示c-kit+細胞在羊水中可能有相對恒定的比例。我們對c-kit+及c-kit-羊水干細胞進行流式細胞儀及免疫細胞化學染色分析。發(fā)現(xiàn)c-kit+細胞強表達間充質(zhì)干細胞標記CD29,CD44, CD73, CD90, CD105), 不表達造血細胞系標記（CD34, CD45）。表達MHCI, 不表達MHCII。發(fā)現(xiàn)c-kit-羊水干細胞也具有間充質(zhì)干細胞特征, 如表達上述間充質(zhì)干細胞標記, 不表達造血細胞系標記。但 Oct-4在c-kit+細胞中占較高的比例（88.44%）,在 c-kit-細胞中占較低的比例（25.19%）。 SSEA-4在c-kit+細胞中占51.54%,在 c-kit-細胞中占3.07%。Oct-4 通常存在于胚胎干細胞及原始胚層細胞中[7],SSEA-4與細胞的未分化狀態(tài)相關(guān)[8], 通常在干細胞中表達, 在分化細胞中不表達。C-kit+羊水干細胞除了具備間充質(zhì)干細胞特征外, 還表達Oct-4及SSEA-4, 提示c-kit+羊水干細胞可能處于成體干細胞及胚胎干細胞的中間階段, 可能比成體干細胞具有更強的分化能力。在對c-kit+及c-kit-羊水干細胞間充質(zhì)分化能力比較時發(fā)現(xiàn), 兩種細胞都可以向成骨、成脂細胞系分化, 并且檢測到骨橋蛋白及脂連素等相關(guān)基因的表達, 然而在心肌樣細胞分化能力上卻出現(xiàn)了差異。通過與新生乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)的方式[9], 誘導后c-kit+羊水干細胞在基因及蛋白水平上均可以檢測到GATA-4, cTnT, α-actin和Cx43 mRNA 的表達。GATA-4 是一種轉(zhuǎn)錄因子, 在心肌細胞的早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用。cTnT是胚胎中骨骼肌細胞或肌原纖維中肌鈣蛋白復合物的成分, 臨床上通常被用于心肌損傷后的檢測標志[10]。肌動蛋白是細胞骨架的主要成分。α-actin是肌動蛋白家族中的亞型[11]?？p隙連接在胚胎發(fā)育、電偶聯(lián)、代謝運輸、凋亡、分化、組織穩(wěn)態(tài)以及癌的發(fā)生中都起到關(guān)鍵作用[12]。Cx43 就是一種縫隙連接蛋白, 主要存在于心房和心室肌細胞中。本研究中, 經(jīng)過誘導的c-kit+羊水干細胞具有以上心肌細胞中的4種相關(guān)基因的表達, 提示c-kit+具有心肌樣細胞的分化能力。誘導后c-kit-羊水干細胞只檢測到GATA-4的基因及蛋白的表達, 提示誘導后的c-kit+細胞更接近成熟的心肌細胞。

我們的研究提示, 通過流式細胞儀分選, 從孕16～22周羊水中可以高效分離純化的c-kit+間充質(zhì)干細胞。雖然c-kit+及c-kit-羊水干細胞具有相似的生物學特征, 但c-kit+羊水干細胞的心肌樣細胞分化能力更強, 可能與c-kit+干細胞具有某種胚胎干細胞特征有關(guān)。

致謝感謝解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實驗室郭亞軍教授的指導及侯盛教授對本文的技術(shù)支持。

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