張新宇, 尹 榕, 付學(xué)鋒*, 趙 波, 萬(wàn)東君

（蘭州軍區(qū)總醫(yī)院: 1干部病房, 2神經(jīng)內(nèi)科, 蘭州 730050；3蘭州軍區(qū)總醫(yī)院473臨床部神經(jīng)內(nèi)科，蘭州 730070）

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái), 阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease, AD）越來(lái)越得到人們的重視。Humanin（HN）是新近發(fā)現(xiàn)的一種多肽, 它能抑制淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein, APP）、早老素 1（presenilin-1, PS1）、早老素 2（presenilin-2,PS2）突變和β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein, Aβ）等誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡, 其在體外的抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)被眾多研究者證實(shí)[1]。我們?cè)缙谠囼?yàn)已經(jīng)證實(shí)HN和HN肽鏈第14位氨基酸被Gly取代的突變體[Gly14]-Humanin（HNG）在體內(nèi)可有效地抑制 Aβ導(dǎo)致的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表達(dá), 本研究通過(guò)檢測(cè)HN對(duì)Aβ誘導(dǎo)的OX-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化的影響, 旨在探討 HN在體內(nèi)對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞是否同樣存在神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雄性昆明小鼠 60只, 2月齡, 體質(zhì)量25～30 g, 由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 清潔級(jí)。隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=15）、Aβ模型組（n=15）和HN治療組（n=30）。

1.2 試劑

HN、Aβ25～35、羊抗兔OX-42單克隆抗體、鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（streptavidin biotin-peroxidase complex, SABC）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品; 其他試劑均為市售分析純。

1.3 AD模型建立

參照Tihda等[2]的方法, 腹腔注射1%戊巴比妥溶液50 mg/kg, 麻醉小鼠, 固定于立體定向儀, 按照小鼠腦立體定位圖譜定位于右側(cè)海馬CA1區(qū)。應(yīng)用微量注射器注入Aβ25～351 μl（注射時(shí)間10 min, 留針10 min）。HN治療組在注射Aβ后立即在同一部位緩慢注入 100 μmol/L HN 溶液 1 μl（注射時(shí)間 10 min, 留針10 min）。假手術(shù)組僅在相同部位入針, 操作同其他兩組。動(dòng)物放置于安靜、溫暖、避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.4 OX-42免疫組織化學(xué)染色

注射后分別于第3, 7, 14 d處死小鼠。鼠腦連續(xù)切片, 切片厚度 30 μm, 隔 4張取 1張。先后加入OX-42一抗（1:200）、二抗（1:500）、SABC（1:500）,采用硫酸鎳氨加強(qiáng)法DAB顯色, 操作按照說(shuō)明書(shū)。陰性對(duì)照組采用同樣濃度的普通兔免疫球蛋白（IgG）代替一抗, 其他步驟相同。

1.5 尼式染色

冷凍切片經(jīng)二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇下行入水, 后用1%焦油紫染色30 min。蒸餾水清洗, 70%乙醇分色數(shù)秒至數(shù)分鐘, 經(jīng)70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各 2 min脫水, 無(wú)水乙醇脫水5 min, 二甲苯透明后樹(shù)膠封固。

1.6 圖像分析處理

采用Image pro plus 5.0軟件對(duì)組織切片進(jìn)行定量分析。每只大鼠取4張切片, 200倍視野下, 于每張切片血腫周邊隨機(jī)選取 4個(gè)視野, 測(cè)出單位面積的OX-42陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析, 數(shù)據(jù)采用±s表示, 方差分析進(jìn)行多組均數(shù)檢驗(yàn), 并用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)3組小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42蛋白的改變

Aβ組小鼠經(jīng)Aβ刺激后3d, 小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài), 以注射點(diǎn)為中心, 注射側(cè)海馬OX-42陽(yáng)性細(xì)胞明顯深染、體積增大、數(shù)量增多, 并達(dá)到峰值; 細(xì)胞形態(tài)清楚, 胞體肥大、腫脹, 突起增粗延長(zhǎng); 注射對(duì)側(cè)海馬也出現(xiàn)活化 OX-42, 細(xì)胞增多、體積增大, 但較注射側(cè)弱; 隨時(shí)間延長(zhǎng), 7, 14d觀察可見(jiàn) OX-42仍深染, 細(xì)胞數(shù)逐漸減少, 但仍多于假手術(shù)組, 胞體仍有肥大、突起增粗延長(zhǎng)。而HN治療組在各時(shí)間段小膠質(zhì)細(xì)胞體積均明顯小于模型組, 且突起減少; 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目多于假手術(shù)組, 但少于模型組（P＜0.05; 圖1, 表1）。

2.2 尼式染色檢測(cè)3組小鼠海馬區(qū)病理改變

Aβ模型組、HN治療組在手術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Nissl染色可見(jiàn)皮質(zhì)有針刺道, 部分有皮質(zhì)缺損, 邊緣不整; Aβ模型組注射側(cè)海馬變形, 有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腫脹以及膠質(zhì)細(xì)胞增生, CA1～CA3區(qū)錐體細(xì)胞消失或排列稀疏、紊亂, 其中炎性的病理變化在注射點(diǎn)最重, 其周?chē)饾u減輕, 隨著時(shí)間的推移, 上述病理變化減弱; HN治療組在相同時(shí)間點(diǎn)炎性的病理變化弱于Aβ模型組。

3 討 論

老年斑是 AD的主要病理特征之一。在以 Aβ為核心的老年斑周?chē)奂罅炕罨男∧z質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞, 同時(shí)在神經(jīng)纖維纏結(jié)、損傷的毛細(xì)血管周?chē)喟l(fā)現(xiàn)有大量的膠質(zhì)細(xì)胞存在, 但其密度最高的部位是在炎性老年斑內(nèi)及其周?chē)Ｔ贏D疾病的早期, 小膠質(zhì)細(xì)胞可吞噬外源性Aβ纖維, 吞噬Aβ后的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活, 激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在Aβ和神經(jīng)炎性斑塊等病理?yè)p害的細(xì)胞應(yīng)答中具有重要作用。研究表明, 星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后, 產(chǎn)生的炎性因子能夠促進(jìn)Aβ聚集, 并進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞, 從而形成惡性循環(huán), 加重老年斑周?chē)难仔苑磻?yīng)[3]。越來(lái)越多的研究證據(jù)表明, 炎性反應(yīng)在AD形成和發(fā)展過(guò)程中具有重要作用, 但迄今仍缺乏有效的防治措施[4]。

圖1 Aβ刺激后3d海馬OX-42陽(yáng)性細(xì)胞Figure 1 Expression of OX-42 in hippocampal region on day 3 (SABC ×200)

圖2 海馬區(qū)病理改變Figure 2 Pathological changes of hippocampus on day 3 (Nissl staining ×200)

表1 3組小鼠海馬陽(yáng)性O(shè)X-42細(xì)胞數(shù)的變化Table 1 Numbers of OX-42 positive cells in hippocampal region (n=15,±s)

表1 3組小鼠海馬陽(yáng)性O(shè)X-42細(xì)胞數(shù)的變化Table 1 Numbers of OX-42 positive cells in hippocampal region (n=15,±s)

注: 與Aβ模型組比較, *P＜0.05

組別 3d 7d 14d假手術(shù)組 88.3±3.0 65.5±4.8 61.5±2.7 Aβ模型組 199.0±7.7 168.8±14.1 137.8±5.0 HN治療組 118.8±13.1* 113.6±9.1* 92.8±9.7*

HN是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子, 由24個(gè)氨基酸殘基組成, 相對(duì)分子質(zhì)量為2656.3。HN是目前發(fā)現(xiàn)的一種既可以抑制多種黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide, FAD）引起的細(xì)胞毒性, 又可抑制Aβ神經(jīng)毒性的神經(jīng)保護(hù)因子[5]。體外研究證明, HN能夠抑制所有的由FAD突變體引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡[6]; HN還能阻斷由Aβ和抗APP抗體在初級(jí)神經(jīng)元中引起的細(xì)胞毒性[7]; 眾多的體外研究表明, HN在微克水平即可表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用[8]; Miao等[9]的實(shí)驗(yàn)證實(shí), HNG可以有效地改善實(shí)驗(yàn)性AD小鼠神經(jīng)行為缺陷。我們先期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), HN及HNG在體內(nèi)均可有效地抑制Aβ毒性導(dǎo)致的GFAP表達(dá), 這種改變有時(shí)間依賴(lài)特征, 與劑量及濃度顯著相關(guān), 且HNG的生物活性作用較HN組更強(qiáng)[10]。

本研究通過(guò)觀察HN對(duì)AD模型小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響作用, 發(fā)現(xiàn)應(yīng)用HN治療后, 海馬區(qū)Aβ注射中心的組織壞死區(qū)域范圍明顯縮小,OX-42的表達(dá)顯著減少。

總之, 本研究表明, HN在體內(nèi)可有效地抑制Aβ毒性導(dǎo)致的OX-42表達(dá), 說(shuō)明HN可以有效治療Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠模型, 具有神經(jīng)保護(hù)作用。HN是否通過(guò)抗炎性反應(yīng)途徑而發(fā)揮抗AD的神經(jīng)保護(hù)作用,仍需要進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)炎性細(xì)胞介質(zhì)表達(dá)的影響加以證明。

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