楊麗霞, 郭瑞威, 齊 峰, 王先梅, 郭傳明, 任 麗, 徐安妨

（成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心血管內(nèi)科, 昆明 650032）

炎癥反應(yīng)在冠心病發(fā)病中起著重要作用, 它不僅貫穿于冠狀動脈粥樣硬化（arteriosclerosis, AS）的全過程, 也是內(nèi)在和外在危險因素導(dǎo)致、尤其是斑塊不穩(wěn)定發(fā)生破裂的中心環(huán)節(jié)。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotaxis protein-1, MCP-1）在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中發(fā)揮有重要作用, 它對動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的特征性細胞-單核/巨噬細胞的遷移和激活起特異性的調(diào)控作用。MCP-1還在多種細胞尤其是構(gòu)成AS病變的 3種主要細胞——單核細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞中表達, 直接或間接地參與了動脈粥樣硬化的形成[1]。本文旨在研究冠心病患者外周血MCP-1-2518 G/A基因多態(tài)性在各類冠心病病變中的變化, 探討它在冠心病尤其是急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome, ACS）發(fā)病中的調(diào)控作用。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2009年1月至2009年10月在成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心內(nèi)科住院行冠狀動脈造影（coronary angiography, CAG）的患者360例, 分為ACS組180例、穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris, SAP）組120例和對照組60例。ACS組包括急性ST段抬高型心肌梗死60例、非 ST段抬高型心肌梗死60例和不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris, UAP）60例。對照組為CAG結(jié)果正常者。急性心肌梗死、UAP、SAP診斷均符合 AHA/ACC診斷標準, 且經(jīng)CAG檢查至少有一只血管病變狹窄程度≥50%,UAP病例同時行心臟血管造影（computed tomography angiography, CTA）檢查病變?yōu)檐洶邏K（CT值小于50Hu）。排除合并腦卒中、嚴重肝腎功能不全、感染、自身免疫疾病、哮喘及腫瘤患者。

1.2 標本處理

ACS患者急診入院時即刻采血, 其余于入院次日清晨空腹12 h采血, 抗凝管取靜脈血3 ml, 3000 r/min離心10 min, 分離血清于-80℃冰箱凍存待測。同時采肘靜脈血采用全自動生化儀測定總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）, 以及紅細胞、白細胞、血小板計數(shù)、纖維蛋白原、肝腎功能等生化指標。

1.3 冠狀動脈造影

患者住院期間常規(guī)選擇性或急診冠狀動脈造影檢查, 冠狀動脈狹窄程度的計算: 采用美國冠狀動脈手術(shù)研究（Coronary Artery Surgery Study, CASS）診斷標準和Gensini評分標準[2], 狹窄≤25%為1分,25%～50%為2分, 50%～75%為4分, 75%～90%為8分, 90%～99%為16分, 100%（閉塞）為32分。不同節(jié)段冠狀動脈評分系數(shù)按 Gensini標準, 狹窄程度評分再乘以一個標志病變位置, 在冠脈樹中重要性的參數(shù)左主干×5; 左前降支近段×2.5; 中段×1.5; 遠段×1; 第一對角支×1; 第二對角支×0.5; 左回旋支近段×2.5, 遠段和后降支、鈍緣支均×1, 后側(cè)支×0.5; 右冠近、中、遠段和后降支均×1, 每例患者冠狀動脈病變程度的最終積分為各分支積分之和。

1.4 MCP-1基因多態(tài)性檢測

（1）基因組DNA的制備。抽取研究對象外周凍存靜脈血, 嚴格按照 DNA提取試劑盒（Tiangen公司，北京）說明書操作。（2）基因組DNA的擴增、酶切。目的基因片段PCR擴增引物序列[3]:上游引物:5-'CCGAG- ATGTTCCCAGCACAG-3', 下游引物:5-'CTGCTT- TGTTTGTGCCTCTT-3'。反應(yīng)體系為 25 μl,其中模板 DNA 200 ng, dNTPs 600μmol/L, 引物各10pmol,Taq酶 0.7 U, 10×Buffer 2μl, 適量的滅菌ddH2O。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min, 然后按94℃變性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 重復(fù)35個循環(huán),最后 72℃延伸 10 min。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶PvuⅡ?qū)CR擴增產(chǎn)物在37℃下進行酶切1h。取6μl酶切產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上進行電泳, 以1000bpMarker為參照, 紫外燈下觀察、拍照并分析其結(jié)果。

1.5 采用ELISA法測定MCP-1水平

試劑盒購自大連泛邦生物工程有限公司, 操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析, 計量資料用±s表示, 多組間均數(shù)比較用單因素方差分析（AVONA）法; MCP-1-2518G/A多態(tài)性分布及等位基因頻率采用χ2檢驗, 用多元逐步回歸分析法分析冠脈病變Gensini評分與各危險因素的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 MCP-1基因多態(tài)性分析

GG純合子酶切為708 bp和222 bp兩種片段;AG雜合子酶切后為930 bp、708 bp和222 bp三種片段; 若為 AA純合子則因無酶切位點而僅顯示930bp一種片段（圖1）。

圖1 MCP-1 2518位點PVU Ⅱ酶切圖Figure 1 Digestion of MCP-1 2518 with Pvu Ⅱ

2.2 MCP-1基因多態(tài)及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律

表 1結(jié)果表明, 各組間基因類型、等位基因頻率不同, ACS組GG明顯高于SAP及對照組（33.4%vs24.2%, 33.4%vs15.0%,P＜0.05）, AA型基因ACS組較 SAP組及正常對照組降低（31.1%vs43.3%, 31.1%vs51.7%,P＜0.05）, AG型基因三組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）; ACS組G等位基因頻率高于SAP組及對照組（51.1%vs40.4%, 51.1%vs31.7%,P＜0.05）, ACS組A等位基因頻率分布較SAP組及正常對照組降低（48.9%vs59.6%, 48.9%vs68.3%,P＜0.05）。

表1 各組基因型及等位基因頻率分布Table 1 Distribution frequency of genotype and allele in every groups

2.3 MCP-1各型基因MCP-1濃度比較

AA型、AG型GG型依次升高（P＜0.05）。見表 2。

表2 MCP-1各型基因間MCP-1濃度比較Table 2 MCP-1 concentration in every genotype(±s)

表2 MCP-1各型基因間MCP-1濃度比較Table 2 MCP-1 concentration in every genotype(±s)

注: MCP-1: 單核細胞趨化蛋白-1; LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇;HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇; FBG: 空腹血糖。與AA基因型比較, *P＜0.05; 與AG基因型比較, #P＜0.05

基因型 MCP-1(ng/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)FBG(mmol/L)AA 124±15 2.58±0.25 1.37±0.35 5.5±0.5 AG 136±18* 2.57±0.36 1.32±0.24 5.8±2.0 GG 153±22*# 2.62±0.35 1.35±0.18 6.0±2.2*

2.4 MCP-1-2518G/A基因多態(tài)與冠狀動脈病變Gensini評分多元回歸分析

以冠狀動脈病變 Gensini評分為應(yīng)變量, 以各危險因素為自變量進行多元逐步回歸分析, 有四個因素進入回歸方程, 依次為 HDL-C、LDL-C、空腹血糖、MCP-1基因類型, 結(jié)果示冠狀動脈病變Gensini評分與 LDL-C、空腹血糖、MCP-1基因類型成正相關(guān), 冠狀動脈病變 Gensini評分與 HDL-C呈負相關(guān), 詳見表3。

表3 冠狀動脈病變Gensini評分影響因素的多元回歸分析Table 3 The multiple regression analysis of risk factors of Gensini score of coronary artery lesions

3 討 論

冠心病的發(fā)病是一個多因素參與、多種細胞因子相互調(diào)控形成的復(fù)雜炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的冠狀動脈狹窄病變或斑塊破裂引起的急性冠狀動脈事件。其病變過程不僅受到外在生活方式、環(huán)境因素等的影響,同時還與自身遺傳等內(nèi)在因素密切相關(guān), 眾多研究顯示基因多態(tài)性是參與冠心病發(fā)病的一個遺傳因素,近期發(fā)現(xiàn) MCP-1-2518G/A位點基因多態(tài)性與冠心病密切相關(guān), Szalai等[4]研究318例冠心病患者得出-2518G/A的變異可能為冠心病易感發(fā)病的遺傳危險因素。McDerotte等[5]也發(fā)現(xiàn)了該位點基因多態(tài)性與缺血性心臟病相關(guān)。Jemaa等[6]研究提示 MCP-1基因-2518G/A多態(tài)性與心肌梗死相關(guān)。我們對行冠狀動脈造影 300例冠心病患者和 60例患者采用PCR-RFLP方法檢測 MCP-1-2518G/A位點多態(tài)性,我們的研究顯示, MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性 GG型基因ACS組（33.4%）較SAP組（24.2%）及正常對照組（15.0%）升高; ACS組G等位基因頻率分布（51.1%）較SAP組（40.4%）及正常對照組（31.7%）升高, 經(jīng)χ2檢驗，P＜0.05。AA型基因 ACS組（31.1%）較SAP組（43.3%）及正常對照組（51.7%）降低; ACS組A等位基因頻率分布（48.9%）較SAP組（59.6%）及正常對照組（68.3%）降低, 經(jīng)χ2檢驗，P＜0.05。據(jù)此，我們認為GG型基因及G型等位基因與冠心病的炎癥反應(yīng)嚴重程度相關(guān), GG型基因及G型等位基因在冠心病尤其是 ACS易損斑塊炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

多元回歸分析 MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性與冠狀動脈病變 Gensini評分相關(guān)性顯示,MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性與冠狀動脈粥樣硬化的狹窄程度呈正相關(guān), 提示MCP-1及其-2518G/A基因多態(tài)性與冠心病炎癥反應(yīng)嚴重程度相關(guān)。MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性參與冠心病發(fā)病的機制未見報道, 我們認為 MCP-1-2518G/A位點位于MCP-1啟動子區(qū)域, MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性為功能性的, 因此該位點基因的多態(tài)性可能通過參與MCP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控參與冠心病的發(fā)病。在MCP-1的近端調(diào)控區(qū)存在GC盒子, -2518G/A位點位于 MCP-1啟動子近端調(diào)控區(qū), 我們認為 MCP-1基因-2518G/A位點的基因多態(tài)性將決定 MCP-1基因啟動子GC盒, G等位基因形成MCP-1啟動子區(qū)域GC盒, A等位基因則不能形成MCP-1啟動子區(qū)域GC盒。而GC盒是在MCP-1啟動子近端調(diào)控區(qū)上特異結(jié)合反式作用因子刺激蛋白 1（stimulatory protein 1,SP1）增強轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點。SP1是一種強有效的核轉(zhuǎn)錄激活因子[7,8], 細胞內(nèi)絲裂原激活蛋白激酶（mitogen- activated protein kinases, MAPK）是SP-1上游信號分子[9,10]。MAPK/SP-1通過 GC盒子結(jié)合MCP-1基因激活轉(zhuǎn)錄表達MCP-1趨化因子。我們分別對 MCP-1基因-2518G/A位點產(chǎn)生的三種類型GG型較AG型及AA型的患者進行MCP-1濃度測定, 結(jié)果顯示 GG型較 AG型及 AA型升高（P＜0.05）, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 結(jié)果與預(yù)想相一致。

綜上所述, MCP-1-2518G/A基因多態(tài)性與冠心病相關(guān), 其可能通過增強MCP-1轉(zhuǎn)錄表達參與冠心病發(fā)病。

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