鄭雪麗, 苗 雅, 鐘 遠(yuǎn)*, 萬(wàn)麗麗

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院：1老年科, 2藥劑科, 上海 200233）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease, AD）又稱老年癡呆, 是嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的常見疾病。多奈哌齊是目前治療輕中度 AD的推薦藥物,但在臨床研究中發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同的AD患者存在明顯的療效差異, 治療有效率為20%～60%[1]。

CYP2D6是與多奈哌齊密切相關(guān)的代謝酶, 且是肝臟細(xì)胞色素 P450代謝酶家族中最具多態(tài)性的亞型, 研究表明 CYP2D6*10是黃種人最常見的基因多態(tài)性位點(diǎn)[2], 其外顯子1上 C188→T的點(diǎn)突變可導(dǎo)致代謝酶的活性降低, 并且其基因突變頻率存在明顯的種族差異。國(guó)外有報(bào)道, 白種人 CYP2D6基因多態(tài)性與多奈哌齊的療效有關(guān)[3,4], 但國(guó)內(nèi)研究較少。本研究旨在探討我國(guó)漢族人群 AD患者CYP2D6*10基因多態(tài)性與多奈哌齊的療效關(guān)系, 為臨床醫(yī)生合理用藥, 治療AD提供更多的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

2009年1月～2011年3月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院老年科門診或住院患者及健康體檢者?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn)如下: （1）漢族, 年齡≥65歲; （2）由兩名有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師, 依據(jù)美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病學(xué)、語(yǔ)言障礙和卒中研究所及 AD和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)診斷的很可能為AD的患者; （3）神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)估, 10分≤簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表（mini-mental state examination, MMSE）評(píng)分≤23分, 臨床癡呆評(píng)定量表評(píng)分≥1分, 總體衰退量表評(píng)分≥4分, Hachinski缺血量表評(píng)分＜4分; （4）無(wú)膽堿類藥物過(guò)敏史。體檢者入組標(biāo)準(zhǔn)如下: （1）漢族, 年齡≥65歲; （2）神經(jīng)心理學(xué)量表評(píng)估: MMSE≥29分。排除標(biāo)準(zhǔn)如下:（1）患任何引起癡呆的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、癲癇、腦外傷、腫瘤、感染、中毒等; （2）患符合美國(guó)精神病學(xué)會(huì)精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)診斷標(biāo)準(zhǔn)的其他精神疾病; （3）患頭顱 CT、磁共振成像及血液等檢查明確的非AD癡呆; （4）合并服用其他改善認(rèn)知功能的藥物; （5）合并服用其他影響CYP2D6酶功能的藥物（其他抗膽堿酯酶藥物、抗抑郁藥、抗精神病藥、β受體阻滯劑等）。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者（AD組）110例, 男72例, 女38例, 平均年齡（80.6±4.9）歲; 健康體檢者（對(duì)照組）124例, 男83例, 女41例, 平均年齡（80.2±4.7）歲。

1.2 干預(yù)方法

所有 AD患者睡前口服多奈哌齊（商品名: 安理申, 日本衛(wèi)材株式會(huì)社）, 5 mg/d, 1個(gè)月后, 耐受良好者劑量增加至10 mg/d, 干預(yù)治療6個(gè)月。患者于服藥前及治療結(jié)束后, 由經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)定, 隨訪的神經(jīng)心理學(xué)量表為MMSE和 AD評(píng)定量表的認(rèn)知分量表（Alzheimer disease assessment scale-cognitive subscale, ADASCog）。

1.3 CYP2D6*10基因型測(cè)定

應(yīng)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)（restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, RFLP-PCR）方法測(cè)定CYP2D6*10基因型。

1.3.1 提取基因組 DNA 所有試驗(yàn)者, 空腹 12 h,取肘靜脈血5 ml, EDTA抗凝, 利用基因組抽提試劑盒提取基因組 DNA, 分光光度計(jì)測(cè)定基因組 DNA的含量和純度。

1.3.2 擴(kuò)增目的基因片段 按照參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物: 上游引物 5′-CCATTTGGTAGTGAGGCAGGTAT-3’; 下游引物 5′-CACCATCCATGTTTGCTTCTGGT-3′。PCR 反應(yīng)體系為: 0.5～1 μg DNA 模板、2 μl 10×緩沖液（含15 mmol/L MgCl2）、1 μl DMSO、1 μl 2.5 mmol/L dNTPs、10 μmol/L 上下游引物各 0.3 μl、0.25 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μl）, 用蒸餾水補(bǔ)至 20 μl。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù): 94℃預(yù)變性5 min, 94℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共32個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（120V,30 min）。

1.3.3 酶切PCR產(chǎn)物及電泳 酶切體系為: PCR產(chǎn)物 5 μl、ddH2O 12.5 μl、限制性內(nèi)切酶HphI （10 U/μl）0.5 μl、10×緩沖液 2 μl, 置 37.0℃水浴箱 12 h。5 μl酶切產(chǎn)物與1 μl 6×上樣緩沖液混合, 行12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（150 V, 4 h）。

1.3.4 硝酸銀染色及顯影 電泳結(jié)束后, 凝膠采用0.1%AgNO3染色 15 min; 顯影液（1.2%NaOH 和0.4%甲醛）顯影5 min, 拍片觀察。

1.4 血漿多奈哌齊濃度測(cè)定

所有患者服藥6個(gè)月后, 空腹12 h, 取肘靜脈血5 ml, EDTA 抗凝, 離心并分離血漿, －80℃保存待用。應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定血漿多奈哌齊的穩(wěn)態(tài)濃度。

1.4.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱為C18柱; 流動(dòng)相組成為: A相, 5 mmol/L甲酸胺和0.1%甲酸水溶液, B相, 乙腈, pH4.0; 流速0.4 ml/min, 柱溫32℃, 進(jìn)樣量5μl; 采用正離子方式, 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描。

1.4.2 溶液配制與樣品處理 精密稱取多奈哌齊對(duì)照品5 mg, 以50%甲醇溶解并定容, 制成1 g/L的貯備液; 精密稱取尼羅替尼 2 mg, 以甲醇溶解并定容,制成0.2 g/L的貯備液。量取儲(chǔ)備液適量稀釋至1μg/L,作為含內(nèi)標(biāo)沉淀溶液。取血漿樣品30 μl, 加5 mmol/L甲酸胺, 0.1%甲酸溶液 30 μl, 振搖, 再加含內(nèi)標(biāo)的0.1%甲酸乙腈溶液120 μl, 振搖, 15 970g離心10 min,取上清層進(jìn)樣分析。

1.4.3 線性范圍 取空白血漿加入多奈哌齊系列濃度工作溶液, 制成濃度為0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0,20.0, 50.0, 100.0μg/L的血漿樣品, 按照1.4.2項(xiàng)的方法處理后進(jìn)樣。以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值A(chǔ)為縱坐標(biāo), 濃度c為橫坐標(biāo), 進(jìn)行線性回歸, 回歸方程為: c=0.0687×A＋0.0526,r=0.9981, 表明多奈哌齊在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.4 保留時(shí)間及定量限 多奈哌齊及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.1 min和6.6 min; 血漿中多奈哌齊的最低定量濃度為0.2μg/L 。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料用±s表示, 兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn), 兩組以上計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CYP2D6*10基因型及等位基因頻率分布

CYP2D6*10的PCR擴(kuò)增片段為272 bp（圖1）,該片段中存在限制性內(nèi)切酶HphI的酶切位點(diǎn), 如果出現(xiàn) C188→T突變, 則在 T188位點(diǎn)上形成第二個(gè)HphI酶切位點(diǎn)。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物時(shí), 野生型基因（C/C）可檢測(cè)到213 bp和59 bp酶切片段, 突變雜合子（C/T）可檢測(cè)到213 bp, 112 bp,101bp和59 bp酶切片段, 突變純合子（T/T）為可檢測(cè)到112 bp, 101 bp和59bp酶切片段（圖2）。

圖1 CYP2D6*10 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜Figure 1 Agarose gel electrophoresis of CYP2D6*10 PCR amplification fragment

圖2 CYP2D6*10三種基因型非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳圖譜Figure 2 Non-denaturant polyacrylamide gel electrophoresis of CYP2D6*10 three genotypes

AD組110例患者中96例完成6個(gè)月隨訪, 其余 14例由于腹瀉、失眠等副作用失訪。96例患者中C/C型27例、C/T型25例、T/T型44例; C和T的等位基因頻率為 41.1%和 58.9%。對(duì)照組 124例完成隨訪, 其中C/C型25例、C/T型44例、T/T型55例; C和T的等位基因頻率為37.9%和62.1%。AD組與對(duì)照組的CYP2D6*10基因型和等位基因頻率卡方檢驗(yàn), 顯示差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05;表 1）。

2.2 多奈哌齊血藥濃度與認(rèn)知量表評(píng)分

AD患者按照CYP2D6*10基因型不同分為C/C組、C/T組和T/T組, 3組在性別、年齡、受教育時(shí)間及治療前MMSE和ADAS-Cog評(píng)分的比較, 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）, 表明3組基線資料基本匹配, 具有可比性（表2）。

表1 CYP2D6*10基因型及等位基因頻率分布Table 1 Genotypes of CYP2D6*10 and distribution of allele frequency

表2 3組間基線資料比較Table 2 Demographic and cognition scores of three CYP2D6*10 genotypes (±s)

表2 3組間基線資料比較Table 2 Demographic and cognition scores of three CYP2D6*10 genotypes (±s)

項(xiàng)目 C/C組(n=27)C/T組(n=25)T/T組(n=44)性別(男/女) 19/8 20/5 27/17年齡(歲) 80.6±4.6 81.0±4.0 81.3±4.7受教育時(shí)間(年) 12.6±4.5 13.6±3.4 13.2±3.4 MMSE(分) 21.4±1.8 20.8±2.1 20.8±2.5 ADAS-Cog(分) 14.8±4.0 14.7±4.2 15.4±3.6

服藥 6個(gè)月后, CYP2D6*10基因突變組（C/T和 T/T組）的血藥濃度分別為（50.0±12.7）μg/L和（59.0±13.0）μg/L, 而野生型基因組（C/C組）的血藥濃度為（40.1±14.0）μg/L, 3組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05; 表3）。

表3 血藥濃度及認(rèn)知量表比較Table 3 Donepezil Cp and cognition scores of different CYP2D6*10 genotypes (±s)

表3 血藥濃度及認(rèn)知量表比較Table 3 Donepezil Cp and cognition scores of different CYP2D6*10 genotypes (±s)

注: 與C/C組比較, *P＜0.05, **P＜0.01; 與C/T組比較, #P＜0.05

項(xiàng)目 C/C組(n=27)C/T組(n=25)T/T組(n=44)穩(wěn)態(tài)血藥濃度(μg/L) 40.1±14.0 50.0±12.7* 59.0±13.0**#MMSE(分) 21.0±3.0 23.1±2.5* 23.3±3.6**△MMSE(分) －0.4±2.6 2.3±2.6** 2.3±2.2**ADAS-cog(分) 14.9±4.1 12.2±3.3** 12.6±3.3*△ADAS-cog(分) 0.1±2.9 －2.5±3.8* －2.8±1.9**

C/T組和T/T組的MMSE和ADAS-Cog評(píng)分與C/C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;△MMSE比較, C/T組和T/T組約增加2.3分, 而C/C組約下降0.4分, 前兩組與C/C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;△ADAS-Cog比較, C/T組和T/T組分別約下降2.5分和2.8分, 而C/C組約增加了0.1分,前兩組與 C/C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05,P＜0.01; 表 3）。

3 討 論

某些研究表明, AD患者的年齡、性別、受教育時(shí)間和基礎(chǔ)認(rèn)知水平的差異對(duì)多奈哌齊療效有一定程度的影響[6], 而個(gè)體代謝藥物的酶基因多態(tài)性對(duì)多奈哌齊的療效差異性也是目前研究的重點(diǎn)[3,4], 故本研究排除了上述年齡等因素, 探討了 CYP2D6基因多態(tài)性與多奈哌齊的療效的關(guān)系。

CYP2D6基因位于 22q13.1～13.2, 根據(jù)酶活性的不同將個(gè)體分為四種表型: 弱代謝者（poor metabolizers, PM）、中間代謝者（intermediate metabolizers, IM）、泛代謝者（extensive metabolizers,EM）和超快代謝者（ultra rapid metabolizers, UM）[7]。人群中約 80%為 EM, 但其他表型卻存在明顯的種族差異, 其中白種人7%～10%為PM, 5%為UM, 而亞洲人最常見的突變類型是IM, PM僅0.94%[8]。有報(bào)道, 白種人AD患者, 服用多奈哌齊3個(gè)月測(cè)定其CYP2D6基因型、血藥濃度及MMSE評(píng)分, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), UM者的血藥濃度明顯低于EM者, 且臨床療效差于EM者[3]; 此外有學(xué)者發(fā)現(xiàn), CYP2D6多態(tài)性位點(diǎn) rs1080985C→G點(diǎn)突變導(dǎo)致代謝酶的活性增強(qiáng),并且量表評(píng)分表明, 多奈哌齊對(duì)基因突變型患者的療效差于野生型患者[4]。國(guó)內(nèi)有研究表明, 70例AD患者服用多奈哌齊 6個(gè)月, 血藥濃度高的患者反而臨床療效差[9]。除此之外, 國(guó)內(nèi)外未見類似報(bào)道, 并且上述研究結(jié)果存在爭(zhēng)議, 仍需進(jìn)一步研究。

文獻(xiàn)報(bào)道, CYP2D6*10基因突變頻率中國(guó)大陸人群為 48.0%～70.0%[2,10]、日本人 40.8%[11]、白種人僅1.5%[12]。本研究表明, 對(duì)照組的基因突變頻率為62.1%, 與上述報(bào)道吻合, 并且與AD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 表明 AD患者基因突變率與正常人群相似。此外, 研究表明, CYP2D6*10基因突變組的血藥濃度明顯高于野生型基因組, 并且前者的認(rèn)知評(píng)分明顯優(yōu)于后者, 但突變純合子（T/T組）和突變雜合子（C/T組）的認(rèn)知評(píng)分差異卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們考慮, 雖然測(cè)出T/T組和 C/T組的血藥濃度具有差異性, 但由于血藥濃度并不是唯一影響藥物療效的因素, 并且納入研究的樣本量相對(duì)偏小,研究周期較短, 并且目前量表評(píng)分帶有一定主觀性,故兩組的療效無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究表明, 多奈哌齊對(duì)漢族人群 AD患者CYP2D6*10基因突變型的療效好于野生型患者, 并且其基因突變頻率較高, 故測(cè)定該基因多態(tài)性可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理選擇藥物劑量, 對(duì)野生基因型療效差的患者可及早增加藥物劑量, 但該研究結(jié)果仍需大樣本、多中心的證據(jù)支持。此外, 探討多奈哌齊的治療機(jī)制及與其療效的相關(guān)性也是我們繼續(xù)研究的方向。

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