周 輝，牟洪超，孫 茂，董立軍

在肝癌的治療中，手術(shù)切除被認(rèn)為是首選的方法，雖然術(shù)后配合介入治療、微波治療、射頻消融、生物免疫療法等，但肝癌的病死率仍然很高，術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者術(shù)后長(zhǎng)期生存的首要原因。大量研究表明腫瘤血管生成是惡性腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)[1]，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 是血管形成的關(guān)鍵因子，VEGF通過(guò)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受 體 （vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）結(jié)合后使受體磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路而實(shí)現(xiàn)促血管形成效用。肝癌組織中癌細(xì)胞依靠豐富的新生血管網(wǎng)快速生長(zhǎng)，并通過(guò)血管網(wǎng)在肝內(nèi)發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。近年許多研究已發(fā)現(xiàn)VEGF在肝癌組織中廣泛表達(dá)，促進(jìn)血管形成，促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[2]。本文通過(guò)免疫組化檢測(cè)肝癌手術(shù)切除標(biāo)本VEGF及VEGFR，分析它們與肝癌的臨床病理特征及術(shù)后生存率的聯(lián)系，以了解它們對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響及評(píng)估預(yù)后，為預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及提高術(shù)后生存率提供更多方法。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本組76例為在筆者所在醫(yī)院肝膽外科2004-03～2007-12住院的手術(shù)患者，均為首次手術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，術(shù)前未行放、化療或介入治療，術(shù)后均依據(jù)不同病情行1~2次介入治療，術(shù)后至少隨訪2年以上，開(kāi)始2年內(nèi)1~3個(gè)月隨訪1次，以后6~12個(gè)月隨訪1次，最長(zhǎng)已隨訪5年，生存時(shí)間從手術(shù)之日起開(kāi)始計(jì)算。男59例，女17例；年齡34~61歲，平均48.7歲。有乙肝病史者69例，丙肝病史者3例，無(wú)肝炎者4例；合并不同程度肝硬化64例，無(wú)明顯肝硬化12例；術(shù)前肝功能均為Child-A級(jí)；術(shù)前AFP>400 ng/L 59例，AFP≤400 ng/L 17例；增強(qiáng)CT掃描檢查發(fā)現(xiàn)腫塊位于肝右葉43例，左葉27例，左內(nèi)與右前葉交界部位4例，尾狀葉2例；腫塊單發(fā)69例，有2~3個(gè)病灶者7例 (6例為局限于1葉或1段內(nèi)，1例為右后葉及左外葉各1個(gè)病灶)；有門靜脈轉(zhuǎn)移者9例，形成膽管癌栓者3例，術(shù)后病理證實(shí)伴肝段或肝葉內(nèi)微小灶轉(zhuǎn)移灶者12例，所有76例術(shù)前檢查均排除遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移；腫塊直徑>5 cm者61例，≤5 cm者15例；腫瘤界限清楚存在假包膜者41例，界限不清無(wú)明顯包膜或包膜不完整35例；術(shù)后病理檢查高分化19例、中分化36例、低分化21例。

1.2 免疫組化染色 VEGF、VEGFR測(cè)定：選取肝癌手術(shù)標(biāo)本中無(wú)壞死的部分以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋。組織蠟塊切片、脫蠟，免疫組化法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），嚴(yán)格按試劑盒操作流程說(shuō)明進(jìn)行操作。鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人VEGFR單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、二抗試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品，采用免疫組化SP法做VEGF和VEGFR兩種免疫組化檢測(cè)，VEGF和VEGFR工作濃度均為1∶50，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF表達(dá)主要見(jiàn)于腫瘤細(xì)胞漿中，為胞漿內(nèi)棕黃色粗大顆粒，部分胞膜也有表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較少；VEGFR主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而肝癌細(xì)胞漿呈弱陽(yáng)性表達(dá)。參照文獻(xiàn)運(yùn)用高倍鏡（@200）于染色密集區(qū)每片隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，每視野計(jì)分為陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率的得分之和：無(wú)染色0分，弱染色（淺黃）1分，中等染色（棕黃）2分，強(qiáng)染色（棕褐色）3分；陽(yáng)性細(xì)胞率<5%計(jì)0分，5%~25%計(jì)1分，26~50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。各視野得分的平均值作為最終得分：0分為陰性，1~2分為弱陽(yáng)性，3~4分為中度陽(yáng)性，5~6分為強(qiáng)陽(yáng)性，并把陰性和弱陽(yáng)性合并作為陰性結(jié)果，而中陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性合并作為陽(yáng)性結(jié)果[3]。本組76例中無(wú)陰性表達(dá)，故將弱陽(yáng)性作為陰性統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)。壽命表法計(jì)算無(wú)瘤生存率，單因素生存時(shí)間對(duì)比分析采用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料及兩因素相關(guān)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌患者手術(shù)2年后無(wú)瘤生存率 全部76例術(shù)后隨訪2年以上，無(wú)失訪者，術(shù)后1年有29例復(fù)發(fā)，術(shù)后2年復(fù)發(fā)19例，按壽命表法計(jì)算術(shù)后第1、2年累計(jì)平均無(wú)瘤生存率分別為61.85%±5.57%、40.97%±5.63%。

2.2 分析肝癌術(shù)后生存時(shí)間的影響因素 臨床中影響肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間的因素很多，根據(jù)臨床實(shí)際情況主要分析年齡、性別、有無(wú)肝硬化、有無(wú)病毒性肝炎、術(shù)前AFP水平、術(shù)前肝癌在肝內(nèi)是否轉(zhuǎn)移、腫塊大小、腫塊數(shù)目、腫塊包膜情況、腫瘤分化程度和VEGF、VEGFR的表達(dá)水平與術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系，先逐個(gè)做單因素分析對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)性別、年齡、病毒性肝炎、肝硬化、術(shù)前AFP水平及腫瘤分化程度對(duì)術(shù)后生存時(shí)間影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而VEGF、VEGFR陽(yáng)性表達(dá)和術(shù)前肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、腫塊大小、腫塊數(shù)目、腫瘤有無(wú)假包膜對(duì)生存時(shí)間的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.3 VEGF、VEGFR與轉(zhuǎn)移、腫塊體積、腫塊數(shù)目及腫瘤包膜之間的相互關(guān)系 將免疫組化染色的標(biāo)本與已知陰性片對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)VEGF陽(yáng)性表達(dá)61例，陽(yáng)性率80.3%，VEGFR陽(yáng)性表達(dá)67例，陽(yáng)性率88.2%。對(duì)肝癌術(shù)后生存時(shí)間有明顯影響的六項(xiàng)指標(biāo)中，肝癌體積大小、轉(zhuǎn)移情況、有無(wú)包膜與VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān) （P<0.05）， 說(shuō)明VEGF、VEGFR陽(yáng)性表達(dá)者能促進(jìn)血管快速形成，加速腫瘤生長(zhǎng)，增加腫瘤的侵襲性，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

2.4 VEGF、VEGFR的表達(dá)與術(shù)后2年復(fù)發(fā)的關(guān)系將術(shù)后第1、2年后復(fù)發(fā)患者的VEGF、VEGFR表達(dá)的情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以了解之間的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)（P<0.05），說(shuō)明 VEGF、VEGFR 陽(yáng)性表達(dá)者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能性明顯增大，無(wú)瘤生存時(shí)間短。

2.5 VEGF、VEGFR表達(dá)的關(guān)系 將VEGF、VEGFR的表達(dá)情況進(jìn)行相互比較分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR的表達(dá)相互之間具有相關(guān)性 （P<0.05），說(shuō)明在肝癌組織中VEGF、VEGFR二者之間的表達(dá)具有相互促進(jìn)作用。

3 討 論

正常情況下，VEGF在人體內(nèi)維持在一個(gè)較低水平，在生理需要的情況下，如胚胎形成、骨骼生長(zhǎng)等時(shí)VEGF表達(dá)增加，促使血管快速形成，滿足機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，但在病理狀態(tài)下，如腫瘤的形成過(guò)程中腫瘤細(xì)胞也表達(dá)大量的VEGF，形成血管網(wǎng)，以促進(jìn)腫瘤的快速擴(kuò)展和蔓延。這種情況在肝癌組織中表現(xiàn)的更加顯著，臨床及病理均已證實(shí)肝癌是一種富血管腫瘤，在肝癌組織中存在大量的腫瘤新生血管。大量資料表明VEGF是腫瘤血管形成的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子，在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，VEGF表達(dá)程度與肝癌組織內(nèi)微血管密度一致，并在肝癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[4]。在本組76例中無(wú)陰性表達(dá)，VEGF呈陽(yáng)性表達(dá)有61例，陽(yáng)性率80.3%，比其它文獻(xiàn)結(jié)果略高[2，4]，估計(jì)可能與樣本選擇、樣本數(shù)大小、檢測(cè)方法、對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)等不同有關(guān)，但結(jié)論還是一致。在本組肝癌組織中VEGF呈高表達(dá)，筆者推測(cè)VEGF陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)，腫瘤新生血管網(wǎng)越多，腫塊生長(zhǎng)越快，本組61例陽(yáng)性表達(dá)患者中有56例為直徑>5 cm者，筆者考慮這種VEGF高表達(dá)促血管生成及腫瘤生長(zhǎng)的作用可能是腫瘤在快速生長(zhǎng)過(guò)程中由于腫塊缺血缺氧誘導(dǎo)刺激癌細(xì)胞通過(guò)自分泌和旁分泌途徑表達(dá)大量VEGF的緣故，這與其它文獻(xiàn)報(bào)道相符[1，2]，其余15例統(tǒng)計(jì)為陰性者其實(shí)也呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，但大部分是直徑<5 cm的患者，術(shù)前影像學(xué)檢查即顯示為少血供腫瘤，這也從另一面說(shuō)明了這一點(diǎn)。

原發(fā)性肝癌號(hào)稱為“癌腫之王”，主要是從肝癌的生物學(xué)行為角度說(shuō)的，因肝癌惡性度高，侵襲性強(qiáng)，術(shù)后易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，因而長(zhǎng)期生存率低。近年來(lái)對(duì)于肝癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)做了大量研究，有許多指標(biāo)可以用于預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和生存時(shí)間，除了一些臨床及病理特征對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存時(shí)間的影響可以作為預(yù)測(cè)項(xiàng)目外，VEGF作為預(yù)測(cè)指標(biāo)正日漸得到臨床的認(rèn)可[6]。本文資料顯示VEGF、VEGFR陽(yáng)性表達(dá)和術(shù)前肝癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、腫塊大小、腫塊數(shù)目、腫瘤有無(wú)包膜等因素對(duì)復(fù)發(fā)和生存時(shí)間的影響明顯，而腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、有無(wú)假包膜等與VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)相互之間也密切相關(guān)，說(shuō)明VEGF、VEGFR高表達(dá)能促進(jìn)血管快速形成，加速腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)移，統(tǒng)計(jì)全組復(fù)發(fā)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)患者與VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)緊密相聯(lián)，存在顯著的相關(guān)性，據(jù)此并結(jié)合其他文獻(xiàn)研究結(jié)果得出結(jié)論VEGF、VEGFR是影響肝癌發(fā)展方向的重要因素之一，可以作為術(shù)后預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。

在腫瘤組織中VEGF、VEGFR是通過(guò)自分泌和（或）旁分泌途徑，聯(lián)合調(diào)控腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和血管形成的，并且VEGF、VEGFR的表達(dá)相互關(guān)聯(lián)。VEGF和VEGFR類型雖多種多樣，但許多研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中VEGF的表達(dá)主要是VEGF165，主要分布于肝癌細(xì)胞漿內(nèi)，VEGFR表達(dá)以VEGFR-2為主，主要分布在巨噬細(xì)胞和腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，只有二者結(jié)合才能產(chǎn)生促血管形成、促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效應(yīng)[1，4]。通過(guò)本組76例肝癌標(biāo)本的研究筆者發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)主要見(jiàn)于肝癌細(xì)胞漿中，免疫組化染色為胞漿內(nèi)棕黃色粗大顆粒，部分胞膜也有表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較少，而VEGFR主要在肝癌組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，癌細(xì)胞漿僅呈弱陽(yáng)性表達(dá)，并且在61例VEGF陽(yáng)性患者與67例VEGFR陽(yáng)性患者中，有56例同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)，因此筆者認(rèn)為VEGF誘導(dǎo)的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中與VEGFR在肝癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)也是密切相關(guān)的。

總之肝癌的生長(zhǎng)離不開(kāi)持續(xù)和廣泛的血管生成，抑制新生血管可能成為治療肝癌的另一種有效的新方法。由于VEGF的表達(dá)與血管生成和肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)都密切相關(guān)，因而抑制和阻斷肝癌細(xì)胞所分泌的VEGF的生物活性對(duì)遏制肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高肝癌術(shù)后生存時(shí)間等方面有重要意義。

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