李 濤，范 波，楊晉生，古選民

自體顱骨片是顱骨缺損修補(bǔ)術(shù)最為理想的修補(bǔ)材料，術(shù)前材料的消毒及保存方法有高壓滅菌法、輻照法、深低溫(-80℃)法及環(huán)氧乙烷(ethylene oxide,EO)法。高壓滅菌方法對(duì)骨組織的強(qiáng)度影響較大，無法滿足移植后強(qiáng)度的要求；輻照法和深低溫(-80℃)法設(shè)備要求復(fù)雜，難以在普通醫(yī)院推廣；EO滅菌法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，目前多數(shù)醫(yī)院配備有此類設(shè)備，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療材料和器械的消毒，但該消毒方法是否可以應(yīng)用于顱骨滅菌尚存在爭(zhēng)論。本文初步觀察了游離顱骨組織用EO滅菌的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料采用神經(jīng)外科去骨瓣減壓術(shù)中切除的成人顱骨片32例，其中男23例，女9例，年齡22～57歲，腦外傷27例，腦出血6例，所有骨材料均經(jīng)家屬同意并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取頂結(jié)節(jié)處切割成1 cm×1 cm大小，內(nèi)、外板及板障結(jié)構(gòu)完整，全層厚約1 cm的骨粒共104粒。

1.2方法

1.2.1 消毒前預(yù)處理 3%醫(yī)用雙氧水常溫下浸泡骨粒24 h，再次更換雙氧水后浸泡24 h，去除顱骨內(nèi)的殘留蛋白。置于50℃烘箱內(nèi)4 h，1∶1氯仿甲醇室溫下脫脂4 h，更換脫脂劑后重復(fù)1次，蒸餾水反復(fù)漂洗后，在自然條件下晾干，存放于通風(fēng)環(huán)境中1個(gè)月。消毒前于40℃，相對(duì)濕度40%的溫箱內(nèi)存放4 h預(yù)濕，用雙層環(huán)氧乙烷專用剝離式包裝袋包裝，每袋1粒，環(huán)氧乙烷指示膠帶(3M公司生產(chǎn))置于內(nèi)層，嚴(yán)格檢查包裝袋有無漏氣及破損。

1.2.2 消毒方法 所用EO滅菌器為3M公司生產(chǎn)的8XL型，環(huán)氧乙烷指示膠帶為3M公司提供；骨材料按一定間距裝入滅菌器，滅菌方法：熱循環(huán)60℃，冷循環(huán)37℃；相對(duì)濕度50%；EO濃度600 mg/L，滅菌時(shí)間5 h，且指示膠帶由黃綠色變?yōu)殚偌t色。

1.2.3 培養(yǎng)方法 將上述滅菌后的骨粒分為兩組，每組均為52粒，A組骨粒置于自然通風(fēng)環(huán)境下10 d，B組骨粒置于自然通風(fēng)環(huán)境下3個(gè)月，嚴(yán)格在無菌條件下粉碎成顆粒狀后加入5 mL無菌生理鹽水，密閉后充分震蕩3 min，離心后取上清液1 mL，每組標(biāo)本等分后，行需氧及厭氧細(xì)菌培養(yǎng)。需氧培養(yǎng)基為10 g/L 葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)3～9 d，如有混濁，接種于羊血培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)72 h。厭氧培養(yǎng)為石蕊-牛乳培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)8～24 h。菌種按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第2版)進(jìn)行鑒定，如有酵母樣菌落生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)種至沙保羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.4 評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) 滅菌后標(biāo)本行細(xì)菌培養(yǎng)，以培養(yǎng)無細(xì)菌生長(zhǎng)作為骨材料無菌指標(biāo)，并進(jìn)行陽(yáng)性樣本細(xì)菌的鑒定。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)菌陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié)果

A組標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果：金葡菌4例，表葡菌2例，枯草芽孢菌6例，標(biāo)本的陽(yáng)性率為33.33%。B組標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果：金葡菌5例，表葡菌2例，枯草芽孢菌8例，標(biāo)本的陽(yáng)性率為41.57%。兩組標(biāo)本均未培養(yǎng)出厭氧菌。兩組標(biāo)本陽(yáng)性率相比χ2值分別為：金葡菌0.1073，表葡菌0.1324，枯草芽孢菌0.3547，總陽(yáng)性率0.5333。經(jīng)χ2檢驗(yàn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

EO是一種低分子量的環(huán)氧化合物，其分子式為C2H4O，呈無色透明狀，有芳香氣味。EO穿透性較強(qiáng)，在適當(dāng)條件下，可以殺滅各類微生物，包括細(xì)菌的繁殖體、芽孢、病毒和真菌孢子。其滅菌的原理是EO與微生物的蛋白質(zhì)，DNA和RNA發(fā)生不可逆的烷化作用，從而導(dǎo)致微生物的死亡，在目前的各種化學(xué)消毒劑或滅菌劑中效果最好。

EO的滅菌效果受以下4種因素影響：滅菌溫度、相對(duì)濕度、EO濃度和滅菌時(shí)間，上述各值除EO濃度外，其余各值越大，滅菌效果越好，EO的最佳濃度取決于其他參數(shù)值。一般用于同種異體骨滅菌的參數(shù)為：溫度20～60℃；有效濕度30%～60%；EO濃度450～1 500 mg/L，滅菌時(shí)間2～5 h[1]。本實(shí)驗(yàn)采用的參數(shù)接近于滅菌最有效值。

EO易于穿透剝離式包裝袋，殘留量較少，有人建議滅菌后的保存有效期為10個(gè)月[2]。顱骨的板障部分處于兩層致密的骨皮質(zhì)之間，其內(nèi)為蜂房狀結(jié)構(gòu)，阻礙了EO的進(jìn)一步揮發(fā)和穿透。在類似實(shí)驗(yàn)中皮質(zhì)骨的標(biāo)本陽(yáng)性率較低[2]，本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率與之相比有所增加并隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性率增高，可能與松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)對(duì)EO的穿透性阻礙有關(guān)。這也導(dǎo)致松質(zhì)骨的保存時(shí)間可能更短。

制備符合修補(bǔ)的自體顱骨片有兩個(gè)關(guān)鍵因素：顱骨片的強(qiáng)度和顱骨滅菌的徹底性，有報(bào)道認(rèn)為，EO僅能穿透致密的皮質(zhì)骨約6 mm，建議僅用于顆粒骨的滅菌[2]。顱骨修補(bǔ)所用的材料可以在顱骨上打孔以增加顱骨內(nèi)、外側(cè)組織的爬行，加速移植的骨支架與組織的融合，同時(shí)也增加了滅菌的有效性，這是本文對(duì)這種滅菌方法應(yīng)用探討的基礎(chǔ)。就目前現(xiàn)有的技術(shù)條件，很難做到使骨孔間的骨體積均小于6 mm×6 mm，EO對(duì)整塊游離顱骨片的滅菌效果必定更不理想，這與Jho等采用此方法臨床實(shí)踐結(jié)論不一致[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)結(jié)果也證實(shí)了不同的微生物對(duì)EO的耐受性不相同：桿菌對(duì)EO滅菌敏感，而球菌則相對(duì)較差，芽孢對(duì)EO的抵抗最強(qiáng)；厭氧菌及真菌對(duì)EO的耐受性也較差。

用于回植的離體骨滅菌方法有多種，其中除EO法外，較為可行的有γ射線輻照、深低溫保存(-80℃)、巴氏滅菌法及高壓蒸汽滅菌等方法，其中以高壓蒸汽滅菌法對(duì)骨強(qiáng)度的破壞最明顯，其次為γ射線輻照，EO滅菌法對(duì)骨強(qiáng)度的破壞最小[5]，標(biāo)準(zhǔn)25 kGy的劑量輻照后，骨的抗壓縮性能降低25%，而且回植后移植骨的吸收也顯著增加[6-7]，由于輻照設(shè)備的復(fù)雜性，不適合醫(yī)院使用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單純EO滅菌法不適合游離顱骨片自體移植使用，能否找到一種既達(dá)到理想的滅菌效果，又保持顱骨片的強(qiáng)度的方法需要進(jìn)一步探索，將上述滅菌方法結(jié)合起來使用可能是可行的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃靖雄.環(huán)氧乙烷滅菌[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004,14(12):1435-1439.

[2] Wingenfeld C，Egli RJ,Hempfing A，et al.Cryopreservation of osteochondral allografts:dimethyl sulfoxide promotes angiogenesis and immune tolerance in mice[J].J Bone Joint Surg Am,2002,84(8):1420-1429.

[3] Jho DH,Neckrysh S,Hardman J,et al.Ethylene oxide gas sterilization:a simple technique for storing explanted skull bone[J].J Neurosurg,2007,107(2):440-445.

[4] Misssori P,Polli FM,Rastelli E,et al. Ethylene oxide sterilization of autologous bone flaps following decompressive craniectomy[J].Acta Neurochi,2003,145(10):899-903.

[5] Zhou Z,Qin T,Yang J,et al.Mechanical strength of cortical allografts with gamma radiation versus ethylene oxide sterilization[J].Acta Orthop Belg,2011,77(5):670-675.

[6] Nguyen H,Morgan DA,Forwood MR.Sterilization of allograft bone: effects of gamma irradiation on allograft biology and biomechanics [J].Cell Tissue Bank,2007,8(2):93-105.

[7] Biau DJ,Larousserie F,Thévenin F,et al.Results of 32 allograft-prosthesis composite reconstructions of the proximal femur[J].Clin Orthop Relat Res,2010,468(3):834-845.