黃 強(qiáng)，費 軍，余洪俊，黃顯凱

隨著對細(xì)菌生物膜相關(guān)感染的重視，近年來我院創(chuàng)傷外科報道的內(nèi)植物金黃色葡萄球菌生物膜相關(guān)感染發(fā)生率顯著增加［1］，93．5%的創(chuàng)傷慢性難愈合創(chuàng)面檢測出金葡菌生物膜感染［2］。細(xì)菌黏附在生物體或者植入物表面，分泌胞外基質(zhì)，組成一個具有高度結(jié)構(gòu)性的膜狀復(fù)合物，呈現(xiàn)與浮游菌不同的表型，導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)作難以控制，即細(xì)菌生物膜相關(guān)感染，目前臨床對其治療手段有限［3］。生物膜內(nèi)的金葡菌對抗菌素的耐藥能力比浮游的金葡菌高10～1000倍，有些抗菌素如氨基糖甙類抗菌素甚至可以誘導(dǎo)細(xì)菌形成生物膜［4］。研究抗菌素對金葡菌形成生物膜的過程中的影響對臨床預(yù)防和治療金葡菌生物膜相關(guān)感染以及了解生物膜引起的細(xì)菌耐藥有重要意義。萬古霉素是對于浮游的金葡菌，包括甲氧西林耐藥金葡菌(methicillinresistant staphylococcus aureus，MRSA)都敏感的重要的殺菌藥物，但在細(xì)菌形成生物膜后其療效也明顯下降［5－6］。萬古霉素是否也會誘導(dǎo)生物膜的形成，其在金葡菌形成生物膜過程中的作用如何國內(nèi)外無文獻(xiàn)報道。因此我們選擇了萬古霉素，對加入萬古霉素的金葡菌菌液在玻片上形成生物膜的過程進(jìn)行了研究，探討萬古霉素對金葡菌形成生物膜早期黏附能力的影響。

材料與方法

1 實驗材料

菌株:金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923(第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所大坪醫(yī)院檢驗科提供)。藥物:萬古霉素(日本禮來公司)，參照2005版“實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)”公布的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)范圍，為1．0mg/L［7］。試劑、儀器:LIVE/DEAD Bacterial Viability Molecular Probes試劑盒(Europe BV公司，荷蘭);熒光增白劑(Sigma公司，美國);激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國)。

2 方法

2．1 金葡菌孵育 將1．0cm×1．0cm大小蓋玻片經(jīng)121°C高溫高壓消毒25分鐘，烘干后放入無菌6孔培養(yǎng)板內(nèi)備用;用胰胨大豆培養(yǎng)瓊脂平板轉(zhuǎn)金葡菌過夜(20小時)，再挑單菌落于10ml胰胨大豆培養(yǎng)肉湯中，搖勻約20小時后，將菌液用生理鹽水稀釋至約1．0×108cfu/L;于備用的無菌6孔板中，每孔加入2μl稀釋的菌液及50μl胰胨大豆培養(yǎng)液，于37°C 恒溫箱培養(yǎng)3、6、8、12、24、48 小時觀察金葡菌生物膜的形成。

2．2 觀察萬古霉素對金葡菌胞外多糖基質(zhì)及玻片上黏附的細(xì)菌菌落的影響 (1)金葡菌孵育(方法同前)。(2)在金葡菌孵育開始，實驗分組按照0．5、1．0、2．0、4．0mg/L 的濃度梯度(分為 1/2MIC、1MIC、2MIC和4MIC組)分別加入萬古霉素，于37°C恒溫箱培養(yǎng);3、6小時后取出玻片。(3)觀察黏附的細(xì)菌胞外多糖基質(zhì)胞外多糖用熒光增白劑染色［8－9］。取出玻片經(jīng)滅菌生理鹽水多次充分漂洗，去掉浮游菌，加入75μg/ml熒光增白劑，室溫下作用40分鐘，再漂洗3～5次，甘油溶液封片，濕潤狀態(tài)下用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察。鏡下藍(lán)色熒光部分為熒光增白劑染色的黏附細(xì)菌自身分泌的多糖基質(zhì)。(4)在避光條件下，將玻片培養(yǎng)液去除，去離子水輕輕洗滌，除去未黏附細(xì)菌;在表面滴加50μl配制好的LIVE/DEAD Bacterial Viability Molecular Probes熒光染液，37°C避光條件下作用15分鐘，置CLSM進(jìn)行檢測。試劑盒含有2種染液:SYT09和 PI，其中SYT09可使活菌發(fā)出綠色熒光，而PI則使死菌發(fā)出紅色熒光，從而可以觀察到玻片上的金葡菌菌落。(5)圖像處理:使用 Image-Pro Plus Version6．0(Media Cybernetics公司，美國)圖像分析軟件處理圖片，每組重復(fù)3張，每張取3個隨機(jī)視野，分別測出黏附金葡菌分泌的多糖基質(zhì)被染色的面積和累積光密度(integrated optical density，IOD)以及細(xì)菌菌落的IOD值。

3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0．05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 金葡菌生物膜的形成

為了確定實驗菌株能形成生物膜以及實驗藥物作用于生物膜的合適時間，我們觀察了金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923生物膜的形成過程。金葡菌培養(yǎng)4～6小時處于黏附階段、6～8小時開始分泌胞外多糖基質(zhì)(聚集階段)、18～24小時生物膜就初步形成(成熟階段)。金葡菌在培養(yǎng)24小時，多糖基質(zhì)呈團(tuán)塊狀、云霧狀，之間已經(jīng)連合在一起，表面生物膜已經(jīng)形成(圖1)。

圖1 金葡菌培養(yǎng)24小時形成的生物膜

2 早期黏附階段萬古霉素對金葡菌胞外多糖基質(zhì)的影響

從IPP軟件處理后的面積和IOD的數(shù)據(jù)來看，萬古霉素作用3小時，4MIC組的多糖基質(zhì)的面積和IOD值與空白對照組比較出現(xiàn)了顯著性差異，P＜0．05;6小時，各實驗組所測得的面積及IOD值均與空白對照組明顯增多，有顯著性差異，P＜0．05。顯示萬古霉素早期能明顯刺激金葡菌多糖基質(zhì)的增多(表1、2 及圖2、3)。

3 早期黏附階段萬古霉素對金葡菌與玻片黏附的影響

對CLSM圖像肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，加入萬古霉素各組的黏附金葡菌落數(shù)都比同時相點的空白對照組多(圖4、5)。我們進(jìn)一步計算了金葡菌菌落的IOD值發(fā)現(xiàn):金葡菌菌液加入萬古霉素3小時后對黏附在玻片上金葡菌菌落的IOD值雖然有所增加，但沒有顯著性差異;6小時后1/2MIC組、1MIC和2MIC組的金葡菌菌落的IOD值明顯增多，與空白對照組比較有顯著性的差異，P＜0．05;只有4MIC組的金葡菌菌落的IOD值與空白對照組差異不顯著。提示1/2MIC組、1MIC和2MIC的萬古霉素明顯刺激了金葡菌在玻片的黏附(圖6)。

4 金葡菌生物膜形成階段萬古霉素對胞外多糖基質(zhì)的影響

金葡菌繼續(xù)孵育至12小時，加入萬古霉素各組的金葡菌多糖基質(zhì)與空白對照組相比才出現(xiàn)了減少，各實驗組的面積及IOD值與空白對照組有顯著性差異，P＜0．05。24小時后，1MIC及以上各組的面積和IOD值比空白對照組明顯減少，P＜0．05，而低于抑菌濃度(1/2MIC組)的萬古霉素組的面積和IOD值與空白對照組比較則差異不顯著，這提示只有加入大于1MIC的萬古霉素才能抑制金葡菌生物膜的形成(表1、2)。

表1 萬古霉素對金葡菌多糖基質(zhì)面積的影響(±s)

表1 萬古霉素對金葡菌多糖基質(zhì)面積的影響(±s)

與空白對照組比較:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．001

組別3h 6h 12h 24h 1/2MIC 790．00 ±360．40 2183．33 ±923．90* 12482．50 ±3984．50＊＊16875．25 ±3610．10 1MIC 385．50 ±65．30 3364．00 ±1885．30＊＊ 9475．20 ±4481．10＊＊ 9029．00 ±3114．10＊＊2MIC 504．64 ±226．60 2998．33 ±427．70* 13147．25 ±4153．00＊＊ 10837．25 ±3836．60＊＊4MIC 1029．20 ±782．10* 3908．33 ±2030．70＊＊ 7478．25 ±1845．40＊＊ 7760．40 ±4460．40＊＊空白對照組 213．25 ±47．20 269．00 ±93．60 21352．20 ±7561．40 26438．50 ±2557．00

表2 萬古霉素對金葡菌多糖基質(zhì)IOD的影響(±s)

表2 萬古霉素對金葡菌多糖基質(zhì)IOD的影響(±s)

與空白對照組比較:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．001

組別3h 6h 12h 24h 1/2MIC 1695．62 ±1023．50 3510．56 ±1482．10* 20057．21 ±6414．80＊＊27133．60 ±5810．90 1MIC 618．86 ±111．10 5400．09 ±3026．40＊＊ 15237．78 ±7204．20＊＊ 14586．04 ±5094．80＊＊2MIC 816．30 ±153．70 4815．24 ±689．10* 9843．86 ±5619．10＊＊ 11900．63 ±7195．10＊＊4MIC 4193．90 ±3875．10＊＊ 6273．83 ±3259．90＊＊ 12005．63 ±2964．00＊＊ 12458．70 ±7161．10＊＊空白對照組 312．22 ±30．00 403．84 ±140．30 34290．07 ±12125．20 42774．90 ±4126．10

圖2 3小時黏附金葡菌產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)

圖3 6小時黏附金葡菌產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)

圖4 3小時黏附金葡菌

圖5 6小時黏附金葡菌

圖6 早期黏附階段萬古霉素對黏附金葡菌IOD值的影響

討 論

本研究采用間接測定和直接觀察的手段，使用多糖及DNA染料，通過CLSM成像、IPP圖像軟件測量黏附細(xì)菌菌落及胞外多糖基質(zhì)，觀察加入萬古霉素的金葡菌菌液在玻片上形成生物膜的過程，初步了解了萬古霉素對金葡菌形成生物膜過程中各個階段的影響。

研究結(jié)果顯示，在加入萬古霉素組的玻片上3小時即可看到熒光增白劑染色的金葡菌分泌的胞外多糖，而文獻(xiàn)報道在初始黏附階段，細(xì)菌一般不分泌多糖基質(zhì)，細(xì)菌在黏附到表面后才大量分泌［10］，而金葡菌一般孵育6～8小時才開始分泌胞外多糖基質(zhì)，是萬古霉素的加入使金葡菌菌分泌多糖基質(zhì)時間提前;從染色的胞外多糖的面積和IOD值看，金葡菌孵育3小時后4MIC濃度的萬古霉素即刺激了金葡菌胞外多糖基質(zhì)的增多，其他各個濃度的萬古霉素在6小時后也都促進(jìn)了金葡菌分泌多糖基質(zhì)的增加，這些都表明萬古霉素能夠刺激金葡菌分泌胞外多糖基質(zhì)。對于黏附在玻片上的金葡菌，1/2MIC組、1MIC組和2MIC組的萬古霉素均能明顯刺激菌落數(shù)增多。只有4MIC組沒有出現(xiàn)黏附的細(xì)菌菌落數(shù)增多，這與藥物濃度升到4MIC后6孔板孔內(nèi)金葡菌浮游的活菌數(shù)量過少有關(guān)。作為高效的金葡菌殺菌劑，萬古霉素在加入到培養(yǎng)液后，使金葡菌黏附在玻片上的數(shù)量反而增多，形成的多糖基質(zhì)面積增大，細(xì)菌分泌多糖基質(zhì)時間提前;也就是說在金葡菌生物膜形成的早期黏附階段，萬古霉素能促進(jìn)金葡菌與材料表面的黏附，并刺激金葡菌分泌胞外多糖基質(zhì)，促使金葡菌與材料表面的黏附能力增強(qiáng)。

細(xì)菌從最初在生物體或者多聚物表面黏附到逐漸形成生物膜是一個動態(tài)的過程［11］。萬古霉素促進(jìn)金葡菌與材料表面的黏附能力增強(qiáng)，是否會促進(jìn)金葡菌形成生物膜呢?我們進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)萬古霉素在早期促進(jìn)了金葡菌的黏附和胞外多糖的形成，但隨著藥物濃度的增加以及時間的延長，殺菌效應(yīng)開始顯現(xiàn):孵育初始加入了＞1MIC濃度的萬古霉素的金葡菌菌液在玻片上最終形成的生物膜還是減少的。但加入的萬古霉素濃度＜1MIC時，金葡菌形成的生物膜則沒有明顯減少。提示萬古霉素作為一個對金葡菌高效的殺菌劑，雖然在早期會促進(jìn)金葡菌與材料表面的黏附并形成胞外多糖基質(zhì)，但其能夠依賴強(qiáng)大的殺菌效應(yīng)來抵消這個影響并最終減少生物膜的形成，而一旦其殺菌作用不占優(yōu)勢，則不能有效減少生物膜的形成。

細(xì)菌對宿主表面的黏附是細(xì)菌形成生物膜的的第一步［12］，細(xì)菌的黏附能力普遍被認(rèn)為是評價細(xì)菌生物膜形成能力的重要指標(biāo)［13］。我們首次發(fā)現(xiàn)了萬古霉素能促使金葡菌與材料表面的黏附能力增強(qiáng)，表明在金葡菌形成生物膜的早期黏附階段萬古霉素起到促進(jìn)作用。雖然萬古霉素能夠依靠其對金葡菌強(qiáng)大的殺菌能力能最終減少生物膜的形成，但畢竟其對金葡菌的早期黏附還是起促進(jìn)作用的，不能避免某些特定條件下金葡菌形成生物膜的可能風(fēng)險。生物膜也是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一，萬古霉素對成熟金葡菌生物膜是沒有抑制作用的［14－15］，一旦生物膜形成，萬古霉素的效能將大大降低，并可能出現(xiàn)金葡菌對其耐藥。因此，對于容易形成慢性難愈合創(chuàng)面以及需要使用醫(yī)用內(nèi)植物的創(chuàng)傷病人，萬古霉素使用必須保持大于1MIC的有效濃度，否則有促進(jìn)細(xì)菌形成生物膜和可能產(chǎn)生對萬古霉素耐藥的危險。我們認(rèn)為如果藥物濃度有低于1MIC可能時，萬古霉素不適宜作為預(yù)防用抗菌素。

另外，與金葡菌形成生物膜過程相關(guān)的基因位點中:dlt基因通過磷壁酸影響了細(xì)菌與材料表面的黏附;ica基因編碼了細(xì)胞外生物膜的多聚糖成分。萬古霉素是否通過刺激dlt及ica基因的上調(diào)，加強(qiáng)了金葡菌的黏附能力，促進(jìn)了細(xì)菌胞外多糖的分泌，值得進(jìn)一步研究。

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