李曉艷 張卯年

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)不僅存在視網(wǎng)膜微血管病變，同時(shí)也有視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損害［1］。在糖尿病患者［2］和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)［3］中，都證實(shí)在未出現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管病理改變之前，已存在視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的損傷及功能改變。因此，DR不僅僅是微血管病變，它還是一種神經(jīng)變性性疾病，其病理生理改變可能與微血管病變相關(guān)［4］，甚至是微血管病變的啟動(dòng)因素［5］。視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡是糖尿病早期最主要的病理表現(xiàn)形式。褪黑素是一種強(qiáng)大的自由基清除劑及親脂性抗氧化劑，隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)褪黑素還具有對(duì)抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗凋亡等作用。在糖尿病發(fā)生時(shí)，褪黑素對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有何影響，有關(guān)這方面的研究至今鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組方法 解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供54只健康成年雄性8周齡SD大鼠，體質(zhì)量230～250 g。54只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組及褪黑素組，各組再按4周、8周、12周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為3小組，每組各6只大鼠。正常對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù);糖尿病組大鼠給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60 mg·kg-1，以誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型;褪黑素組在成功建立糖尿病大鼠模型后每天給予褪黑素10 mg·kg-1·d-1灌胃進(jìn)行干預(yù)。取每只大鼠的左眼眼球，制作石蠟組織病理學(xué)切片，進(jìn)行TUNEL檢測(cè)。

1.1.2 藥品和試劑 STZ及TUNEL檢測(cè)試劑盒、褪黑素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖尿病動(dòng)物模型的建立 除正常對(duì)照組外其余大鼠給予一次性腹腔注射STZ 60 mg·kg-1，誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。給藥后48 h剪尾法測(cè)血糖、尿糖(試紙)。模型建立成功標(biāo)準(zhǔn):血糖＞16.7 mmol· L-1，尿糖(+++)以上。

1.2.2 褪黑素干預(yù)方法 STZ誘導(dǎo)糖尿病模型成功的大鼠從模型建立成功即日開(kāi)始，給予每天褪黑素10 mg·kg-1·d-1灌胃，給藥時(shí)間定于每天上午10∶00～11∶00，對(duì)照組及糖尿病組不做任何干預(yù)，各組飼養(yǎng)條件完全相同。

1.2.3 石蠟切片制備 100 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠，快速取出左眼眼球，固定于40 g·L-1多聚甲醛固定液中15～20 min后，從角膜緣剪開(kāi)眼球，小心去除眼前節(jié)和部分玻璃體，余下“眼杯”再次固定2 h左右，依次梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。選擇距視盤(pán)2 mm處連續(xù)切片(厚度4 μm)。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫臘至水化;體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫處理10 min;Proteinase K 37℃消化10 min;取 TdT和DIG-dUTP各1 μL，加入18 μL標(biāo)記緩沖液，混勻后滴加至標(biāo)本片，37℃濕盒內(nèi)標(biāo)記2 h;加封閉液室溫處理30 min;用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后加至標(biāo)本片，37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min;用抗體稀釋液1∶100稀釋Streptavidin-Biotin Complex染色，混勻后加至標(biāo)本片，37℃濕盒內(nèi)反應(yīng)30 min;二氨基聯(lián)苯胺顯色;Mayer蘇木素輕度復(fù)染;水洗、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)計(jì)算方法:凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞/同一視野細(xì)胞總數(shù)×100%。每個(gè)標(biāo)本抽取3張切片，每張切片高倍鏡下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其均值，作為該標(biāo)本的凋亡指數(shù)。每組中6個(gè)標(biāo)本的均值，作為該組的凋亡指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究中的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，正常對(duì)照組與糖尿病組大鼠各時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)采用兩因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法(軟件分析中兩兩比較結(jié)果僅提供具體P值)，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖及體質(zhì)量 正常對(duì)照組:8周時(shí)SD大鼠體質(zhì)量230～250 g，毛色光滑、柔順，禁食12 h后血糖為4.2～6.3 mmol·L-1，尿糖試紙查尿糖為陰性，角膜及晶狀體透明。每天飲水量、尿量正常，體質(zhì)量隨鼠齡增加呈上升趨勢(shì)。隨鼠齡增長(zhǎng)，血糖無(wú)明顯變化，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。糖尿病組:糖尿病模型鼠血糖在19.7～35.5 mmol· L-1之間，按4周、8周、12周時(shí)間點(diǎn)處死時(shí)測(cè)血糖，各組血糖均＞16.7 mmol·L-1，無(wú)血糖自行恢復(fù)者。每天飲水量、尿量明顯多于同期對(duì)照組，隨鼠齡增加體質(zhì)量初期改變不明顯或略有增加，之后呈逐漸下降趨勢(shì)，最終呈現(xiàn)消瘦狀態(tài)。糖尿病模型鼠隨鼠齡增加，部分大鼠晶狀體逐漸趨于混濁。褪黑素組:褪黑素組大鼠血糖均＞16.7 mmol·L-1，4周、8周、12周時(shí)血糖變化均不明顯，與糖尿病各組相比血糖值之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。褪黑素組大鼠與同期糖尿病組大鼠相比，“三多一少”的癥狀略有減輕，表現(xiàn)為每天進(jìn)食量、進(jìn)水量較同期糖尿病組略有減少，隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，褪黑素組體質(zhì)量變化不明顯，至12周時(shí)較同期糖尿病組體質(zhì)量有所增加(P＜0.01)。各組大鼠血糖值及體質(zhì)量詳見(jiàn)表1-表2。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)血糖值Table 1 Blood glucose at each time point in each group (n=6，s，c/mmol·L-1)

Note:Compared with control group，*P＜0.01;Compared with diabetic group，△P＞0.05

Group Blood glucose 4 weeks 8 weeks 12 weeks Control group 4.88±0.51 5.15±0.65 5.28±0.46 Diabetic group 27.75±2.12* 28.85±2.48* 29.40±1.70* Melatonin group 28.40±1.58△ 28.13±2.21△ 28.63±1.55△

2.2 視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡 正常對(duì)照組4周、8周、12周視網(wǎng)膜均未見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡(圖1-圖3)。糖尿病組4周視網(wǎng)膜可見(jiàn)散在的凋亡細(xì)胞分布于內(nèi)核層，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及外核層細(xì)胞未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈深藍(lán)色(圖4)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)為(0.48± 0.53)%;糖尿病組8周大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層凋亡細(xì)胞增多、密度增大，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層也出現(xiàn)明顯染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞(圖5)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)為(5.66± 2.10)%;糖尿病組12周大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層可見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多(圖6)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)為(11.83±1.58)%。褪黑素組4周與同期糖尿病組相比細(xì)胞凋亡程度無(wú)明顯差異(圖7)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)為(0.30±0.74)%;褪黑素組8周及12周神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層凋亡細(xì)胞數(shù)均低于同期糖尿病組(圖8-圖9)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(1.67±0.54)%和(7.73±0.95)%。正常對(duì)照組、糖尿病組、褪黑素組大鼠各時(shí)間點(diǎn)間視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.896，P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較:糖尿病組4周與同期對(duì)照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.405);糖尿病組8周和12周與同期對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000);褪黑素組4周與同期糖尿病組的細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.755)，褪黑素組8周和12周大鼠與同期糖尿病組比較，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000)。

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量Table 2 Body mass at each time point in each group (n=6，s，m/g)

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量Table 2 Body mass at each time point in each group (n=6，s，m/g)

Note:Compared with control group，*P＜0.01，△P＞0.05;Compared with diabetic group，▲P＞0.05，□P＜0.05

Group Body mass 4 weeks 8 weeks 12 weeks Control group 269.00±8.39 370.83±9.58 431.83±15.09 Diabetic group 259.50±10.08△ 247.17±8.42* 241.33±5.35* Melatonin group 261.33±6.65▲ 255.67±7.74▲ 253.00±7.56□

Figure 1 Retinal TUNEL lable at 4 weeks in control group(×400).Figure 2 Retinal TUNEL lable at 8 weeks in control group(×400).Figure 3 Retinal TUNEL lable at 12 weeks in control group(×400).Figure 4 Retinal TUNEL lable at 4 weeks in diabetic group(×400).Figure 5 Retinal TUNEL lable at 8 weeks in diabetic group(×400).Figure 6 Retinal TUNEL lable at 12 weeks in diabetic group(×400).Figure 7 Retinal TUNEL lable at 4 weeks in melatonin treatment group(×400).Figure 8 Retinal TUNEL lable at 8 weeks in melatonin treatment group(× 400).Figure 9 Retinal TUNEL lable at 12 weeks in melatonin treatment group(×400) 圖1 正常對(duì)照組4周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(× 400)。圖2 正常對(duì)照組8周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖3 正常對(duì)照組12周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖4 糖尿病組4周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖5 糖尿病組8周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖6 糖尿病組12周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖7 褪黑素組4周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖8 褪黑素組8周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)。圖9 褪黑素組12周大鼠視網(wǎng)膜TUNEL標(biāo)記(×400)

3 討論

DR雖然是微血管病變，但近年來(lái)已有研究表明，在微血管病變之前，患者視功能已發(fā)生改變［6］，因而早期神經(jīng)保護(hù)非常重要。視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡是糖尿病早期的主要病理改變，TUNEL法是近年來(lái)出現(xiàn)的將分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)技術(shù)，主要用于早期凋亡的檢測(cè)，其敏感性高、特異性較強(qiáng)而且能夠定量的顯示細(xì)胞凋亡的程度，因而是目前廣泛應(yīng)用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):細(xì)胞凋亡主要發(fā)生于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層，細(xì)胞凋亡程度隨病程延長(zhǎng)逐漸加重。Barber等［7］的研究證實(shí)7.5個(gè)月的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層及內(nèi)核層厚度分別比同齡大鼠減少22%和14%，并認(rèn)為其厚度變薄與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

褪黑素是由松果體分泌的一種吲哚胺激素，長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為褪黑素的生物學(xué)作用主要是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、睡眠-覺(jué)醒生物節(jié)律相位轉(zhuǎn)換，改善睡眠等。隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)褪黑素還具有對(duì)抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗凋亡等作用。近年來(lái)，有關(guān)褪黑素對(duì)糖尿病并發(fā)癥保護(hù)作用的研究也越來(lái)越多，主要集中于其能夠提高全身或局部組織的多種抗氧化酶活性、改善氧化應(yīng)激水平、減輕氧化損傷等方面［8］。隨著對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的研究深入，近年來(lái)有學(xué)者開(kāi)始認(rèn)識(shí)到:褪黑素具有強(qiáng)大的線粒體保護(hù)作用，它能夠減輕大鼠缺血-再灌注損傷造成的肝細(xì)胞線粒體的腫脹、保護(hù)線粒體內(nèi)膜的完整、減少細(xì)胞色素C等介質(zhì)的釋放、減輕caspase-3的激活及凋亡形成［9］。目前褪黑素已開(kāi)始逐步用于糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究中［10］，他們發(fā)現(xiàn)其能夠改善高糖狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜或視網(wǎng)膜細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化，而對(duì)于褪黑素對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，至今鮮有報(bào)道。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著褪黑素對(duì)糖尿病大鼠干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，TUNEL法檢測(cè)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況較同期糖尿病組減輕，4周時(shí)無(wú)明顯差異，8周及12周時(shí)差異顯著，12周時(shí)糖尿病組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)為(11.83±1.58)%，而褪黑素組明顯降低，僅為(7.73±0.95)%，內(nèi)核層凋亡細(xì)胞的密度也明顯低于同期糖尿病組，說(shuō)明褪黑素干預(yù)能夠減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中，褪黑素組與同期糖尿病組相比血糖無(wú)明顯變化(P＞0.05)，但“三多一少”的癥狀較糖尿病組有所減輕，一方面說(shuō)明褪黑素對(duì)糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響并非降血糖作用;另一方面提示褪黑素可能在一定程度上改善了糖尿病大鼠的代謝情況。然而，也有研究報(bào)道褪黑素可減輕糖尿病鼠胰島β細(xì)胞的氧化損傷，發(fā)揮較弱的降血糖作用［11］。

已有報(bào)道證實(shí)褪黑素是一種高效的氧自由基吞噬劑及抗氧化劑［12］，其抗氧化能力明顯高于維生素E［13］，改善DNA氧化損傷的效應(yīng)比維生素C和E高60～70倍［14］。褪黑素憑借其強(qiáng)大的抗氧化作用及無(wú)毒性和雙重溶解性的優(yōu)越性，目前正作為新型的抗氧化劑用于臨床實(shí)驗(yàn)的研究中［15］，希望隨著研究的不斷深入，褪黑素能夠早日成為早期DR神經(jīng)保護(hù)的新策略。

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