王威 張紅 劉平

角膜組織工程學(xué)是現(xiàn)代角膜疾病基礎(chǔ)學(xué)研究的重要方法之一，角膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)更是研究角膜的生理學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床應(yīng)用極為重要的手段?，F(xiàn)將近年來國內(nèi)外角膜上皮細(xì)胞組織工程學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及其在眼科臨床應(yīng)用中的進(jìn)展作一綜述。

1 角膜上皮的構(gòu)建

1.1 種子細(xì)胞的選擇 角膜上皮具有自我更新的能力，它是由位于角膜緣的干細(xì)胞增殖分化而來的。1986年Schermer等最先實(shí)驗(yàn)證明角膜上皮干細(xì)胞存在于角膜緣基底層的Vogt柵欄處;Tsubota等最早行異體角膜移植術(shù);Pellegrini等［1］首次通過體外擴(kuò)增角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行眼表重建，成為角膜緣干細(xì)胞移植發(fā)展史上的里程碑。在穿透性角膜移植的同期或分期聯(lián)合施行角膜緣干細(xì)胞移植是目前最理想的移植術(shù)，尤其適合于角膜緣干細(xì)胞嚴(yán)重缺乏的病例。它彌補(bǔ)了當(dāng)前角膜移植術(shù)只能取代混濁的角膜基質(zhì)或失代償?shù)慕悄?nèi)皮，不能迅速上皮化，不能阻止新生血管侵入、排斥反應(yīng)重、手術(shù)失敗率高的缺陷。因其在培養(yǎng)過程中所需角膜緣組織極少，對(duì)供眼無潛在威脅;培養(yǎng)的細(xì)胞可凍存，可用于二次手術(shù);能抑制眼表急性病變發(fā)展，迅速恢復(fù)術(shù)眼正常的眼表結(jié)構(gòu);免疫原性低，符合人的自身發(fā)展?fàn)顩r，成為角膜上皮組織工程重建中最理想的種子細(xì)胞。目前研究中爭(zhēng)論的焦點(diǎn)主要集中在角膜緣干細(xì)胞的特異標(biāo)記物還不能明確［2］，沒辦法闡明角膜緣干細(xì)胞怎樣進(jìn)行分裂及定位，在臨床試驗(yàn)中不能大量提純與增殖等。因此國內(nèi)外學(xué)者不斷嘗試開發(fā)各種細(xì)胞、組織，通過各種方法經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為種子資源，在解決種子細(xì)胞來源匱乏及移植排斥問題上顯示了誘人的前景。如取自周圍血、臍帶血、骨髓中的干細(xì)胞［3］;來源于早期胚胎原始生殖嵴具有無限增殖能力的胚胎干細(xì)胞［4-5］及胚胎皮膚干細(xì)胞［6］;發(fā)育同源性的口腔黏膜皮膚上皮細(xì)胞［7-9］;另外還有結(jié)膜干細(xì)胞［10］、間質(zhì)干細(xì)胞［11-12］、牙髓干細(xì)胞［13］、毛囊干細(xì)胞［14］等，它們或因取材方便，或因體外增殖能力強(qiáng)，或因能表達(dá)角膜特異性標(biāo)記物等吸引眼科學(xué)者不斷進(jìn)行探索，但也因機(jī)械性能差，不能逾越的安全性、倫理性問題，以及僅能形成類角膜上皮樣組織等方面的不足而不能在臨床工作中大量開展應(yīng)用。

1.2 支架材料選擇 當(dāng)前組織工程中的生物材料仍以天然材料、人工合成材料、復(fù)合材料為主。羊膜在眼科應(yīng)用的最早、范圍最廣，現(xiàn)在已經(jīng)能根據(jù)不同需要制備不同的羊膜，通過不斷的改進(jìn)，已能克服制備不標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、不均勻、易脫落，易感染HIV、肝炎，體外培養(yǎng)易發(fā)生“去分化”等缺點(diǎn)［15］。膠原是天然細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，通過交聯(lián)、非醛交聯(lián)及應(yīng)用溶酶體酶技術(shù)對(duì)膠原進(jìn)行改進(jìn)，控制其密度、交聯(lián)方式、孔隙率，改善降解速率，加強(qiáng)其強(qiáng)度與韌性，是支架材料很好的選擇之一［16］;除去了脂質(zhì)膜、膜相關(guān)抗原和可溶性蛋白質(zhì)的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)，免疫原性更低，同時(shí)又保持了天然角膜板層纖維結(jié)構(gòu)、韌性、厚度的特點(diǎn)，其超微環(huán)境更適于細(xì)胞再生與三維重建，還能使不可利用的基質(zhì)得到重新應(yīng)用;纖維凝膠是細(xì)胞外基質(zhì)的多功能成分，具有可以從人及牛血液中制備，提取更方便，來源更豐富［17］的優(yōu)點(diǎn);生物蛋白膜蠶絲蛋白的應(yīng)用是目前研究開發(fā)的熱點(diǎn)［18］;改進(jìn)人工支架材料聚乳酸、多聚已酸［19-20］的代謝及滲透壓等都是目前聚焦的研究方向。各種生物材料在介導(dǎo)細(xì)胞附著、生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，聯(lián)合生物活性分子及生長(zhǎng)因子，保留天然高分子聚合物，表達(dá)二維和三維空間結(jié)構(gòu)，改善代謝及滲透壓，降低細(xì)胞毒性，操作方便等方面都有不斷的突破與改進(jìn)，但它們也有各自不同的缺點(diǎn)及不足。2004年，Nishida等［9］利用簡(jiǎn)單的溫度變化，在無胰酶消化的情況下使細(xì)胞膜片脫落，培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞免疫組織學(xué)檢測(cè)及免疫印跡檢測(cè)顯示角膜上皮樣特征，細(xì)胞間連接與膜片透明性良好。收獲的細(xì)胞膜片易于移植操作，與角膜基質(zhì)黏附緊密，無需縫合。并且易對(duì)密度、厚度、添加成分等進(jìn)行掌控，影響細(xì)胞的黏附與增殖。避免了傳統(tǒng)組織工程中使用胰酶消化或機(jī)械刮取對(duì)培養(yǎng)角膜細(xì)胞完整性的破壞及載體材料對(duì)組織修復(fù)的影響，此即無載體培養(yǎng)。這為組織工程支架材料的應(yīng)用帶來了新的應(yīng)用前景?？傊?，支架材料無毒副作用、組織相容性好、生物可降解性佳，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，是組織工程支架材料的研究方向。

2 微環(huán)境的調(diào)控

干細(xì)胞微環(huán)境學(xué)說最先由Schofield提出，學(xué)說假設(shè)基底部Vogt柵欄內(nèi)的乳頭狀結(jié)構(gòu)深入到基底深層，與血管網(wǎng)接觸，吸收營(yíng)養(yǎng)［21］;基質(zhì)細(xì)胞中分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，誘發(fā)人類組織相容性D抗原輔助T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(HLA-D/Th)［21］，使干細(xì)胞在機(jī)體特殊的內(nèi)環(huán)境作用下保持未分化或分化狀態(tài)動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂與凋亡，促進(jìn)上皮細(xì)胞分化與遷移，延長(zhǎng)干細(xì)胞的存活壽命。體外研究表明很多細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子都能上調(diào)干細(xì)胞的增殖、遷移與分化、促進(jìn)p63高表達(dá)，如腫瘤生長(zhǎng)因子(TGF)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、增益因子(KGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)［22］等。因此基因治療應(yīng)運(yùn)而生，即通過特定的分子生物學(xué)技術(shù)關(guān)閉或降低異?；虻谋磉_(dá)或?qū)⒄５耐庠椿驅(qū)塍w內(nèi)特定的靶細(xì)胞以彌補(bǔ)缺陷基因，或?qū)⒛撤N特定基因?qū)塍w細(xì)胞內(nèi)，反義寡核苷酸阻斷RNA的轉(zhuǎn)錄等以產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)因子表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療作用，使細(xì)胞進(jìn)入不同的形態(tài)或未分化狀態(tài)［23］，調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)上皮細(xì)胞化。

3 培養(yǎng)方法

角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法中，細(xì)胞懸液法能裂解信號(hào)，誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)更多角蛋白K3和K12，似乎更適于細(xì)胞生長(zhǎng)，但尚無完整的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料進(jìn)行證明。以往在組織培養(yǎng)過程中常添加各種成分，如3T3鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH/3T3)、胎牛血清、小牛血清等，在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，也增加了感染與污染的危險(xiǎn)。采用無血清、氣液平面培養(yǎng)，盡量模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)在組織工程制備過程中要求具有“干凈”的實(shí)驗(yàn)室，優(yōu)良、規(guī)范化的制作程序，臨床實(shí)驗(yàn)要求符合法國管理?xiàng)l約(AFSSaPS)和法國健康組織與歐盟指導(dǎo)原則。試驗(yàn)方法要遵照赫爾辛基宣言與人類組織國際道德倫理規(guī)范。終極目標(biāo)是減少成纖維污染，保護(hù)干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的生存環(huán)境，以確保患者在治療過程中的安全性及臨床試驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)研究可靠性。

4 術(shù)后防治措施

免疫抑制劑在異體角膜移植甚至在自體角膜移植中的應(yīng)用都有很成熟的報(bào)道［24］，臨床術(shù)后常單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用的免疫抑制劑有:環(huán)胞霉素、環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)激素［25］，應(yīng)用后9個(gè)月就很難在上皮中找到DNA、HLA-DR抗原和淋巴細(xì)胞。術(shù)后并發(fā)的炎癥、滲出、穿孔、青光眼等常與細(xì)胞培養(yǎng)方式過程中的許多復(fù)雜而未知的因素有關(guān)。因此術(shù)后采用一系列防護(hù)措施，如繃帶式接觸鏡、眼瞼縫合、羊膜縫合等技術(shù)能促進(jìn)角膜上皮化，提高手術(shù)成功率，減少角膜上皮的溶解與排斥。以往臨床普遍采用術(shù)后6個(gè)月的隨訪時(shí)間，但完全角膜上皮化需要9～12個(gè)月的時(shí)間，移植失敗一般發(fā)生在2 a左右，因此采用24個(gè)月術(shù)后隨訪時(shí)間更合理，以便能更好地評(píng)估細(xì)胞治療的安全性與有效性。HLA基因配型可以從根本上防治異體移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、基因敲除技術(shù)的完善，移植免疫排斥的問題將會(huì)被徹底解決。

5 眼表評(píng)估

因?yàn)椴煌难芯空卟捎貌煌囵B(yǎng)方法及實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行研究，樣本采集數(shù)量等也不同，導(dǎo)致評(píng)價(jià)指標(biāo)及結(jié)果有很大差異，從而影響結(jié)果的分析與判斷。在嚴(yán)重的眼表疾病，常伴有結(jié)膜與眼瞼的病理學(xué)改變，術(shù)前要給予恰當(dāng)而準(zhǔn)確的評(píng)估，對(duì)選擇不同的治療方案，估計(jì)預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。目前國際上公認(rèn)應(yīng)在術(shù)前應(yīng)用印跡細(xì)胞學(xué)、共聚焦顯微鏡、熒光染色、照片法及裂隙燈等方法，以最小的侵襲力對(duì)眼附屬器如眼瞼、睫毛、結(jié)膜、淚膜、穹隆深度、角膜瘢痕、新生血管、干眼癥等方面進(jìn)行評(píng)估。并給予如板層角膜移植、結(jié)膜移植等恰當(dāng)?shù)男g(shù)前治療以增加術(shù)后成功率。手術(shù)后僅單純采用視敏度進(jìn)行評(píng)估，由于主觀原因使評(píng)估結(jié)果可靠度差，采用Snellen評(píng)分，術(shù)后大約能提高＞2 Snellen視敏度。并用X+Y=Z方程式來評(píng)價(jià)細(xì)胞生成與丟失的關(guān)系(X代表基底細(xì)胞向角膜中央遷徙，Y代表周圍細(xì)胞向中央遷徙，Z代表剝脫的角膜上皮)［25］及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線都是對(duì)角膜細(xì)胞生長(zhǎng)有效的評(píng)估。問卷調(diào)查患者的生活質(zhì)量也應(yīng)被考慮在術(shù)后評(píng)估的范疇內(nèi)。據(jù)報(bào)道在體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞中如有3%的p63染色陽性，臨床就能使接受移植的患者達(dá)到78%的成功率［26］。這也說明移植成功的關(guān)鍵取決于干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的充足性。目前完整的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)還是很難達(dá)到統(tǒng)一。但在一些西歐國家，是由人類組織權(quán)利機(jī)構(gòu)等對(duì)診斷、材料的來源、培養(yǎng)方式、手術(shù)及術(shù)后護(hù)理進(jìn)行系統(tǒng)規(guī)范管理的。

6 問題與展望

組織工程技術(shù)是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，研究開發(fā)制作用于修復(fù)、改善損傷組織結(jié)構(gòu)和功能替代物的一門技術(shù)。其方法是取少量自體組織的某種細(xì)胞，在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后，將其接種到支架材料上生長(zhǎng)，再將此細(xì)胞支架復(fù)合物植入體內(nèi)或缺損部位，種植的細(xì)胞繼續(xù)增殖，形成新的組織和器官，達(dá)到修復(fù)缺損和重建功能的目的。組織工程技術(shù)自20世紀(jì)80年代興起以來，迅速成為材料科學(xué)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。角膜因其無血管透明，被稱為“免疫赦免區(qū)”，在組織工程中具有重要的意義與地位。角膜組織工程與再生醫(yī)學(xué)的目的不僅是要替換受損和功能障礙的組織，還要恢復(fù)有用視力，而只替換一層角膜病變組織以達(dá)到治療的效果是最理想的治療方法，因此角膜上皮重建對(duì)角膜組織的重建與再生具有重要意義。我國角膜組織工程學(xué)起步于1994年，建立穩(wěn)定的角膜種子細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，成功分離、培養(yǎng)，獲取培養(yǎng)期更長(zhǎng)、傳代數(shù)更多、遺傳特性更穩(wěn)定的種子細(xì)胞，開發(fā)研制新的支架材料，替代功能不良與衰竭的角膜上皮組織，治療不可逆的疾病與損傷，恢復(fù)健康的眼表及視功能，使患者不必經(jīng)歷反復(fù)手術(shù)，終生應(yīng)用免疫抑制劑的痛苦，并創(chuàng)建具有自主產(chǎn)權(quán)的生物產(chǎn)品應(yīng)用于臨床一直是我國組織工程研究者奮斗的目標(biāo)。因此我們必需真正懂得角膜組織工程相關(guān)因素發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其真正的潛能，才能增加植片存活率。盡管在目前的研究與應(yīng)用中還存在這樣那樣的問題，但不可否認(rèn)的是角膜組織工程重建是能真正有希望治療角膜盲疾病最有效的措施。

1 Pellegrini G，Traverso CE，F(xiàn)ranzi AT，Zingirian M，Cancedda R， De Luca M.Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated human epithelium［J］.Lancet，1997，349(9057):990-993.

2 Chee KY，Kicic A，Wiffen SJ.Limbal stem cells:the search for a marker［J］.Clin Experiment Ophthalmol，2006，34(1):64-73.

3 Kerkis I，Kerkis A，Dozortsev D，Stukart-parsons GC，Gomes Massirosi SM，Pereira LV，et al.Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers［J］.Cells Tissues Organs，2006，184(3-4):105-116.

4 Ahmad S，Stewart R，Yung S，Kolli S，Armstrong L，Stojkovic M et al.Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche［J］.Stem Cells，2007，25(5):1145-1155.

5 Liu Qi，Chen WP.Research progress in the application of embryonic stem cells in vitro culture system in ophthalmology［J］. Yanke Yanjiu，2009，27(5):420-433.

6 Zhou SY，Zhang C，Baradaran E，Chuck RS.Human corneal basal epithelial cells express an embryonic stem cell marker OCT4［J］.Curr Eye Res，2010，35(11):978-985.

7 Nakamura T，Endo K，Kinoshita S.Identification of human oral keratinocyte stem/progenitor cells by neurotrophin receptor p75 and the role of neurotrophin/p75 signaling［J］.Stem Cells，2007，25(3):628-638.

8 Tao Q，Qiao B，Lv B，Zheng C，Chen Z，Huang H.p63 and its isoforms as markers of rat oral mucosa epidermal stem cells in vitro［J］.Cell Biochem Funct，2009，27(8):535-541.

9 Nishida K，Yamato M，Hayashida Y，Watanabe K，Yamamoto K，Adachi E，et al.Cornea reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium［J］.N Engl J Med，2004，351(12):1187-1196.

10 Dogru M，Tsubota K.Survival analysis of conjunctival limbal grafts and amniotic membrane transplantation in eyes with total limbal stem cell deficiency［J］.Am J Ophthalmol，2005，140(2): 305-306.

11 Du Y，F(xiàn)underburgh ML，Mann MM，SundarRaj N，F(xiàn)underburgh JL.Multipotent stem cells in human corneal stroma［J］.Stem Cells，2005，23(9):1266-1275.

12 Arnalich-Montiel F，Pastor S，Blazquez-Martinez A，F(xiàn)ernandez-Delgado J，Nistal M，Alio JL，et al.Adipose-derived stem cells are a source for cell therapy of the corneal stroma［J］.Stem Cells，2008，26(2):570-579.

13 Gomes JA，Geraldes Monteiro B，Melo GB，Smith RL，Cavenaghi Pereira da Silva M，Lizier NF，et al.Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of human immature dental pulp stem cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51 (3):1408-1414.

14 Meyer-Blazejewska EA，Call MK，Yamanaka O，Liu H，Schl?tzer-Schrehardt U，Kruse FE，et al.From hair to cornea:toward the therapeutic use of hair follicle-derived stem cells in the treatment of limbal stem cell deficiency［J］.Stem Cells，2011，29(1): 57-66.

15 Madhira SL，Vemuganti G，Bhaduri A，Gaddipati S，Sangwan VS，Ghanekar Y.Culture and characterization of oral mucosal epithelial cells on human amniotic membrane for ocular surface reconstruction［J］.Mol Vis，2008，14(2):189-196.

16 Duan X，McLaughlin C，Griffith M，Sheardown H.Biofunctionalization of collagen for improved biological response:Scaffolds for corneal tissue engineering［J］.Biomaterials，2007，28(1): 78-88.

17 Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration［J］.N Engl J Med，2010，363(2):147-155.

18 Harkin DG，George KA，Madden PW，Schwab IR，Hutmacher DW，Chirila TV.Silk fibroin in ocular tissue reconstruction［J］. Biomaterials，2011，32(10):2445-2458.

19 Wu J，Du Y，Watkins SC，F(xiàn)underburgh JL，Wagner WR.The engineering of organized human corneal tissue through the spatial guidance of corneal stromal stem cells［J］.Biomaterials，2012，33(5):1343-1352.

20 Yoeruek E，Bayyoud T，Maurus C，Hofmann J，Spitzer MS，Bartz-Schmidt KU，et al.Reconstruction of corneal stroma with decellularized porcine xenografts in a rabbit model［J］.Acta Ophthalmol，2012，90(3):e206-210.

21 Rama P，Matuska S，Paganoni G，Spinelli A，De Luca M，Pellegrini G.Limbal stem cell therapy and long-term corneal regeneration［J］.N Engl J Med，2010，363(2):147-155.

22 Cheng CC，Wang DY，Kao MH，Chen JK.The growth-promoting effect of KGF on limbal epithelial cells is mediated by upregulation of Np63 through the p38 pathway［J］.J Cell Sci，2009，122 (Pt 24):4473-4480.

23 Tseng SC，Chen SY，Shen YC，Chen WL，Hu FR.Critical appraisal of ex vivo expansion of human limbal epithelial stem cells［J］.Curr Mol Med，2010，10(9):841-850.

24 Daya SM，Watson A，Sharpe JR，Giledi O，Rowe A，Martin R，et al.Outcomes and DNA analysis of ex vivo expanded stem cell allograft for ocular surface reconstruction［J］.Ophthalmology，2005，112(3):470-477.

25 Ahmad S，Osei-Bempong C，Dana R，Jurkunas U.The culture and transplantation of human limbal stem cells［J］.J Cell Physiol，2010，225(1):15-19.

26 Colabelli Gisoldi RAM，Pocobelli A，Villani CM，Amato D，Pellegrini G.Evaluation of molecular markers in corneal regeneration by means of autologous cultures of limbal cells and keratoplasty［J］.Cornea，2010，29(7):715-722.