張連升，梁 永，崔飛倫

(1興化市人民醫(yī)院，江蘇興化225700;2兗州市九一醫(yī)院;3江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院)

前列腺癌(PCa)在歐美地區(qū)發(fā)病率較其他國家或地區(qū)高，占?xì)W美男性癌癥的第2位，是發(fā)達(dá)國家導(dǎo)致男性死亡的主要威脅之一［1］。腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因(APC基因)編碼的APC蛋白是個多功能抑制腫瘤的蛋白家族，直接參與Wnt信號傳導(dǎo)途徑，還參與細(xì)胞骨架兩種主要成分微絲和微管的調(diào)節(jié)。2011年10月～2012年3月，我們檢測了60例前列腺癌患者APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化情況，觀察其APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化率的變化，分析環(huán)境危險因素的作用，探索預(yù)防和早期診斷PCa的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2007年10月～2011年9月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院收治的60例新發(fā)PCa患者為PCa組，年齡61～86(75.85±6.79)歲，均經(jīng)臨床病理證實。Gleason評分4～7分者56例，8～10分者4例。另取40例良性前列腺增生(BPH)患者為BPH組，年齡64～84歲。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 由統(tǒng)一的調(diào)查員，利用統(tǒng)一的調(diào)查表，按照規(guī)定內(nèi)容采用面試方式進(jìn)行調(diào)查，逐一詢問并如實填寫，所有內(nèi)容均獲得調(diào)查者的同意。收集的環(huán)境危險因素包括體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、飲酒、喝茶、吸煙、體育運動等。飲酒定義為每周至少1次并持續(xù)6個月以上;不飲茶為飲茶次數(shù)＜4次/周，否則為飲茶;吸煙分為不吸、適度吸煙(≤20支/d)、重度吸煙(＞20支/d)三類;運動時間超過30 min為運動1次，不運動為運動頻率＜4次/周，否則為運動。

1.2.2 APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化的檢測 采用亞硫酸鹽修飾后測序法檢測。①樣本處理及提取DNA:切取兩組患者PCa或BPH組織石蠟標(biāo)本，用10%甲醛固定，用DNA提取試劑盒操作流程提取DNA。DNA提取量一般40～120 ng/μL，紫外分光光度計測定峰值260 nm，DNA無RNA和蛋白污染。②亞硫酸氫鹽修飾DNA:用EZ DNA Methylation-Gold TMKit DNA(ZYMO RESEARCH)試劑盒嚴(yán)格按照步驟處理，修飾DNA。③引物設(shè)計:用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計APC基因引物設(shè)計。APC上游引物5'-GGGGTTAGGGTTAGGTAGGTTG-3'，下游引物5'-AACACCTCCATTCTATCTCCAATAA-3'，M13-47引物5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。選APC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 000 bp至第一外顯子區(qū)富含CG位點密集的基因區(qū)824～1 054為研究序列，基因長度231 bp，其中包含13個CG位點。④PCR:反應(yīng)體積50 μL，其中Hot Start Version Taq 0.5 μL，引物各1 μL，dNTP 4 μL，修飾后的DNA 8 μL，余下以ddH2O補齊，所有反應(yīng)皆用ddH2O作為對照。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃ 2 min 40 s，94℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 40 s，37個循環(huán);72℃ 5 min。APC基因產(chǎn)物片段為231 bp。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，隨機選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實驗。⑤PCR產(chǎn)物純化回收:PCR產(chǎn)物經(jīng)Axy Prep PCR清潔試劑盒純化回收后備基因克隆用。⑥目的基因克隆:分別從PCa組和BPH組隨機選取3個DNA樣本進(jìn)行同組混合?；旌虾驞NA用于基因克隆測序。實驗步驟為:pMD18-TVector載體1 μL，PCR產(chǎn)物1 μL，SolutionⅠ5 μL，ddH2O補至10 μL，混均后16℃反應(yīng)90 min，全量(10 μL)加入100 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 mim，42℃加熱60 s后，迅速再次冰浴2 min，加入890 μL的SOC培養(yǎng)(無氨芐西林)，37℃下220 r/min震蕩，培養(yǎng)120 min，全速離心后棄去上清液，涂布于LB瓊脂平板(含氨芐西林100 μg/mL)上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)箱過夜。⑦PCR鑒定克隆及測序:從克隆后菌落中各挑選10個白色孤立克隆，置入200 μL LB液體培養(yǎng)基中搖菌3 h后PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系:鑒定引物RV-M 1 μL，M13-47 1μL，TaqPCR Master Mix 12.5 μL，模板(菌液)1 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃3 min;94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán);72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳，鑒定APC基因大小382 bp(目的基因230 +載體區(qū)152 bp)。鑒定合格后隆送公司(上海邁浦生物科技有限公司)測序。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用雙錄入的方式將實驗室檢測和流行病學(xué)調(diào)查資料錄入計算機。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用χ2檢驗及精確概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa發(fā)病的環(huán)境危險因素 PCa發(fā)生的環(huán)境因素分析表明，PCa發(fā)病與飲酒、飲茶有關(guān)，其相對危險度的比值比(OR)分別為:2.46(95%CI為1.02～5.91)、0.29(95%CI為0.12～0.67);PCa發(fā)病與患者年齡、BMI、吸煙、運動無關(guān)。

2.2 APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化程度 PCa組測序780個CG位點，381個(48.84%)有甲基化;對照組測序520個CG位點，6個有甲基化。PCa組APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化率明顯高于對照組(P＜0.05)。

2.3 APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化與PCa臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。由表1可見，PCa組APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化與血清前列腺特異性抗原(PSA)水平、Gleason評分、TNM分期有關(guān)(P均＜0.05)。

3 討論

到目前為止，PCa的病因及致病機制仍不十分清楚。Lichtenstein等［2］研究表明，42%的PCa患者的發(fā)病可歸因于遺傳因素，其他的則與環(huán)境因素相關(guān)。

表1 PCa組APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)2000年國際肥胖特別工作組提出的亞洲成人體質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)，BMI 18.5～22.9為正常，23～24.9為超重，＞25為肥胖;男性腰圍＞90 cm，女性腰圍＞80 cm，亦屬于中心性肥胖(腹型)。研究認(rèn)為，高BMI與PCa風(fēng)險增加有關(guān)［3］。由于肥胖者細(xì)胞內(nèi)線粒體的脂質(zhì)代謝能力下降，導(dǎo)致氧化損傷物質(zhì)積聚，為腫瘤的發(fā)生提供了條件［4］。而本研究進(jìn)行因素分析時BMI與PCa的關(guān)聯(lián)并沒有顯著意義。

生活行為方式中飲酒因素是目前的研究熱點之一。酒精可以改變體內(nèi)雄激素和雌激素的平衡，從而影響激素依賴型腫瘤如PCa。有研究報道［5］飲酒量與PCa有關(guān)聯(lián):隨著飲酒量的增加，患PCa的危險性升高。但也有研究表明飲酒與PCa發(fā)病無關(guān)聯(lián)［6］。此外酒的種類與PCa發(fā)病有無關(guān)聯(lián)也沒有明確結(jié)論。我們的調(diào)查顯示飲酒與PCa發(fā)生有顯著的關(guān)系，飲酒者患PCa的風(fēng)險是不飲酒者的2.46倍。吸煙不僅是引起肺癌的直接原因之一，也使患PCa的相對危險度增加到 1.5～2.0，并有可能使PCa向惡性程度更高的類型轉(zhuǎn)化［7］。國外有研究認(rèn)為，年輕時過多的吸煙將增加 PCa的患病可能性［8］。但是本研究結(jié)果顯示吸煙與PCa的關(guān)聯(lián)并沒有統(tǒng)計學(xué)意義。綠茶中含有茶多酚類物質(zhì)，能夠引起癌細(xì)胞的死亡，從而發(fā)揮抗癌功效。Henning等［9］的研究首次在人體中證實口服茶多酚后患者前列腺組織中的多酚類物質(zhì)濃度較對照組顯著增高。盡管血清中無法檢測到多酚類物質(zhì)，但是用含口服茶多酚后患者血清的培養(yǎng)液可以在體外顯著抑制PCa細(xì)胞增殖。然而Choan等［10］在一項Ⅱ期臨床試驗中給予19例難治性PCa患者250 mg綠茶提取物2次/d口服，療程至少持續(xù)2個月，然后復(fù)查PSA或進(jìn)行影像學(xué)檢查，結(jié)果顯示綠茶提取物并無積極治療效果。2001～2002年，一項旨在調(diào)查綠茶是否與PCa有病因?qū)W關(guān)系的病例對照研究［11］在中國杭州進(jìn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飲茶量與PCa有關(guān)，綠茶對PCa具有保護(hù)性。其原因是綠茶中含有抗氧化劑。本研究發(fā)現(xiàn)飲茶者患PCa的危險性是不飲茶者的0.29倍，與文獻(xiàn)相符。

Wnt信號傳導(dǎo)通路的異常激活與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。APC基因是Wnt信號的下游抑制因子，APC基因的失活后則會導(dǎo)致β-catenin降解減少，β-catenin從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與Tcf-4相結(jié)合，活化靶基因刺激腫瘤生長［12］。研究證明在結(jié)腸癌等消化道腫瘤中APC基因啟動子甲基化率很高［13］，而在PCa中APC基因甲基化狀況國內(nèi)外相關(guān)報道較少。

亞硫酸鹽修飾后測序法是目前公認(rèn)的研究基因甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)［14］。本研究采用此方法，研究結(jié)果顯示PCa組和BPH組CG位點甲基化發(fā)生率分別為48.84%、1.19%，PCa組高于BPH組。表明APC基因啟動子區(qū)CpG甲基化的發(fā)生與PCa的發(fā)生及臨床病理參數(shù)相關(guān)聯(lián)。由于樣本量較小，本研究的結(jié)果仍需擴大樣本進(jìn)一步驗證，同時可以結(jié)合蛋白組學(xué)進(jìn)一步探討該目的基因在PCa發(fā)生、發(fā)展中的作用。

一些研究表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶能減少阻斷細(xì)胞分化或抑制腫瘤形成［15］。另外，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因在體外實驗中具有抗腫瘤活性，并且能在一定程度上逆轉(zhuǎn)惡性表型［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，APC基因CpG位點甲基化率及環(huán)境因素如飲茶和飲酒在PCa的發(fā)生及發(fā)展中起著一定的作用。APC基因CpG位點甲基化率與飲茶、飲酒之間在PCa的發(fā)病中存在拮抗作用。環(huán)境危險因素與PCa的發(fā)生產(chǎn)生影響，有關(guān)環(huán)境因素、表觀遺傳因素與PCa發(fā)病之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步擴大樣本進(jìn)行更加深入的研究，以揭示其間的關(guān)系。

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