王 曉，楊學(xué)成，陳 濤，王永華，曹延煒，牛海濤，邵世修

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

近年來，隨我國糖尿病(DM)發(fā)病率明顯提高，DM性陰莖勃起功能障礙(ED)日益成為我國ED發(fā)病的主要原因［1］。糖尿病性ED通常被認(rèn)為主要以血管因素和神經(jīng)因素為主，連接蛋白(Cx)43基因表達(dá)則被認(rèn)為與陰莖海綿體平滑肌功能密切相關(guān)［2］。2008年10月，我們檢測(cè)了三種ED模型小鼠的勃起功能和海綿體中的Cx43蛋白表達(dá)變化，旨在進(jìn)一步探討ED發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡清潔級(jí)Wistar大鼠125只，體質(zhì)量200～250 g，經(jīng)與生育期雌性大鼠交配證實(shí)具有正常性功能;Cx43多克隆抗體、SABC試劑盒和3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Cx43多克隆抗體工作液濃度1∶100，鏈脲霉素(STZ)和阿樸嗎啡(美國Sigma公司)。

1.2 動(dòng)物模型建立 將125只Wistar大鼠隨機(jī)分為DM因素組35只、血管因素組31只、神經(jīng)因素組28只及對(duì)照組31只，其中前三組分別按如下方式建模:①DM因素組:DM組腹腔注射STZ 55 mg/kg， 1次/d，連續(xù)4 d。血糖≥16.67 mmlol/L為造模成功，未達(dá)血糖標(biāo)準(zhǔn)者淘汰。②血管因素組:于髂總動(dòng)脈分叉處向左找到左髂總動(dòng)脈，向下可見膀胱上動(dòng)脈起自髂總動(dòng)脈，于其深面找到左髂內(nèi)動(dòng)脈，游離血管周圍組織、筋膜，用6-0絲線于髂內(nèi)動(dòng)脈起始端結(jié)扎左髂內(nèi)動(dòng)脈，同法結(jié)扎右側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈。③神經(jīng)因素組:在10倍外科顯微鏡下仔細(xì)游離前列腺兩側(cè)葉后方，暴露出盆腔星狀神經(jīng)節(jié)，沿盆腔星狀神經(jīng)節(jié)向周圍仔細(xì)分離、識(shí)別出盆神經(jīng)、腹下神經(jīng)(輸入支)及沿尿道側(cè)面走行的最大輸出支——海綿體神經(jīng)，并予以切斷。

1.3 勃起功能試驗(yàn) 各組均于制模后3周進(jìn)行阿樸嗎啡試驗(yàn)，即于每只大鼠頸項(xiàng)部皮下注射阿樸嗎啡(80 μg/kg)30 min后，觀察陰莖勃起(判定標(biāo)準(zhǔn)為陰莖頭膨脹及遠(yuǎn)端陰莖體露出)情況，計(jì)數(shù)勃起次數(shù)。

1.4 陰莖海綿體組織Cx43蛋白表達(dá)檢測(cè)及結(jié)果判定方法 各組分別于8、12、16周分批斷頸處死，解剖分離出陰莖組織，于陰莖近段切取海綿體5 cm，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。用0.5%H2O2/甲醇室溫處理30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗滌3次，滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化4 min，0.5 M的PBS洗滌;每張切片上滴加20 μL兔血清(1∶20)，37℃濕盒20 min。20 μL的Cx43蛋白抗體37℃濕盒60 min; 0.5 M的PBS洗滌，滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃、30 min;滴加SABC，37℃、30 min，0.5 M的PBS洗滌5 min×3次;DAB顯色20～30 min，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片保存。結(jié)果判定:每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)不重復(fù)的高倍視野，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性，計(jì)數(shù)染色陽性細(xì)胞百分率。其中細(xì)胞染色弱、陽性細(xì)胞＜5%為陰性，陽性細(xì)胞5%～50%為弱陽性，陽性細(xì)胞＞50%為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰莖勃起情況 與對(duì)照組相比，血管、神經(jīng)、DM因素組大鼠勃起功能均有明顯喪失(P均 ＜0.01)，見表1。

2.2 陰莖海綿體組織Cx43蛋白表達(dá)情況 DM因素組、血管因素組及神經(jīng)因素組陰莖海綿體組織Cx43蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P均＜0.01)，見表2。

表1 各組陰莖勃起功能情況比較

表2 各組陰莖海綿體組織Cx43蛋白表達(dá)比較

3 討論

ED是指各種原因?qū)е玛幥o血流動(dòng)力學(xué)變化異常引發(fā)的陰莖勃起異常，表現(xiàn)為不能完成正常性生活。許多種因素均可引發(fā)ED，最主要的包括神經(jīng)因素、激素性因素、動(dòng)脈性因素和海綿體因素［3］。研究顯示，DM患者通常比正常人群早10～15 a出現(xiàn)性功能障礙［4］。DM性ED可能受到多種因素影響。DM引起的神經(jīng)和血管病變被認(rèn)為是導(dǎo)致DM性ED的兩大主要因素。DM的全身神經(jīng)病變?cè)贒M早期即可出現(xiàn)，其可使陰莖神經(jīng)傳導(dǎo)受到影響，并引起相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的改變。血管組織改變可能是DM性ED最主要的病理學(xué)改變［5］，而DM可導(dǎo)致大血管和微血管改變，其中DM性大血管病變可造成陰莖供血改變，使陰莖血管管徑變細(xì)、彈性下降;而微血管病變可更進(jìn)一步引起陰莖海綿體血流灌注不足，導(dǎo)致陰莖海綿體組織缺氧以及海綿體平滑肌功能損傷。

陰莖海綿體由網(wǎng)絡(luò)狀海綿體小梁和小梁間隙構(gòu)成，其中小梁含大量平滑肌，平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接是細(xì)胞間液體彌散的重要通道，對(duì)維持組織反應(yīng)的整體性、協(xié)調(diào)性具有重要意義。縫隙連接蛋白包括很多基因家族(其中16種蛋白的作用比較明確)，其命名源自相對(duì)分子質(zhì)量(26～57 kD)。Cx43是縫隙連接蛋白家族中首要的海綿體平滑肌細(xì)胞功能相關(guān)蛋白［6］，是陰莖海綿體平滑肌功能的一個(gè)重要分子生物學(xué)指標(biāo)。李錚等［7］對(duì)9例ED患者以RT-PCR方法進(jìn)行陰莖海綿體組織Cx43 mRNA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ED患者陰莖海綿體Cx43 mRNA表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組。Brink等［8］通過對(duì)大鼠DM模型的研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠陰莖勃起功能下降的同時(shí)，其海綿體細(xì)胞中Cx43相關(guān)縫隙連接通道的電子傳導(dǎo)能力改變，但Cx43影響的機(jī)制和縫隙連接的電子傳導(dǎo)能力之間的相關(guān)性未能得到明確證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，DM因素組、血管因素組及神經(jīng)因素組陰莖勃起比例及次數(shù)均明顯低于對(duì)照組，陰莖海綿體組織Cx43蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，尤以DM因素組為著。進(jìn)一步證實(shí)血管因素、神經(jīng)因素及DM因素均可誘發(fā)ED;DM性海綿體功能損傷與DM性ED相關(guān)。可能機(jī)制是DM可能通過影響Cx43基因表達(dá)造成海綿體平滑肌細(xì)胞縫隙連接功能障礙，從而進(jìn)一步導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌功能降低，陰莖勃起功能喪失。

總之，Cx43蛋白表達(dá)下降在各種因素所致ED發(fā)病中均具有重要作用，尤以DM性ED為著;此為DM性ED的預(yù)防和治療提供了新思路。

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