王 鵬，姜戰(zhàn)武，孫玉國，曲 杰

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000;2保定市第一中心醫(yī)院;3承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，多以糖苷的形式存在于多種植物中，以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高，具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用，臨床上多用于止咳、祛痰、消炎、治療心血管疾病、治療炎癥性脫髓鞘疾病、SARS、干燥性皮膚瘙癢等［1～5］。近年來對木犀草素抗腫瘤作用的研究主要是其抑制腫瘤的增殖與促進(jìn)凋亡［6，7］，未見關(guān)于其抑制胃癌細(xì)胞遷移功能的報道。本研究旨在觀察木犀草素對人胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞體外遷移能力的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胃癌HGC-27細(xì)胞由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI Medium1640培養(yǎng)基干粉和胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Amersco公司產(chǎn)品，二甲基亞砜(DMSO)、Luteolin、MMP-7及β-actin抗體為Sigma公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。Lu溶解在DMSO中，濃度為100μmol/L，－20℃保存，實驗中用相應(yīng)的培養(yǎng)液或溶劑稀釋。

1.1.3 儀器 Primo R型低溫高速離心機(德國Heraeus公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Forma公司)，倒置熒光顯微鏡(Zeiss公司)，HFsafe-1500型生物安全柜(HEAL FORCE公司)，Transwell小皿(Millipore公司)，3633型高壓消毒鍋(美國Yamato scientificwc公司)，HP-8453紫外—可見分光光度計(惠普公司)，梅特勒—托利多AG245電子分析天平(瑞士梅特勒—托利多公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng) HGC-27細(xì)胞置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，用含10%FBS以及青、鏈霉素各100 U/mL的RPM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔容積1 mL，其中3孔分別加入10、20、40 μmol/L的木犀草素溶液100 μL，分別為A、B、C組，另外3孔加入等量DMSO作為對照(對照組)。常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后于倒置相差顯微鏡下直接觀察培養(yǎng)板中腫瘤細(xì)胞形態(tài)特征。

1.2.2 細(xì)胞遷移能力檢測 ①細(xì)胞劃痕實驗:將HGC-27細(xì)胞鋪滿6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁長滿后進(jìn)行劃痕，PBS洗1遍，更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。結(jié)果以培養(yǎng)24 h后HGC-27細(xì)胞覆蓋區(qū)域占起始劃痕面積的百分比表示。②Transwell實驗:取指數(shù)生長期的HGC-27細(xì)胞，胰酶消化，RPM1640培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為每100 μL懸液含5×104個細(xì)胞進(jìn)行鋪板。24孔培養(yǎng)板中每孔加入600 μL含15%小牛血清的RPM1640完全培養(yǎng)基，在Transwell小室的上室分別加入100 μL HGC-27細(xì)胞懸液，各含5×104個細(xì)胞，最后上室加入10 μL的1%BSA，使BSA最終濃度為0.1%，以保持上室內(nèi)的滲透壓。加入不同濃度的木犀草素100 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)15 h。取出小室用90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取4個低倍視野(× 400)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并計算平均值。實驗重復(fù)3次。結(jié)果以實驗組HGC-27細(xì)胞穿膜數(shù)量占對照組細(xì)胞穿膜數(shù)量的百分比表示。

1.2.3 MMP-7水平檢測 采用Western blot法。分別取木犀草素處理前后的HGC-27細(xì)胞均約5× 106個，加入300 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min 4℃離心4 min，取上清液置于－20℃保存。BCA法測定蛋白濃度。每個泳道上樣蛋白量為40 μg，上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE電泳)，80 V電泳30 min，120 V電泳90 min，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用新鮮配制的含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST液)搖床上封閉2 h，加入MMP-7抗體(1∶500)及抗β-Actin抗體(1∶500)，4℃反應(yīng)過夜。然后將膜取出，用PBS液洗滌3次，每次15 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)室溫封閉1 h，然后用PBST液洗滌3次，每次10 min，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測，X線片記錄結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用±s表示。多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)變化 正常培養(yǎng)條件下生長的HGC-27細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈三角形或梭形，輪廓清晰，包膜完整，胞體透亮，貼壁良好。培養(yǎng)24 h后與對照組相比A組HGC-27細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化;B組HGC-27細(xì)胞開始皺縮，生長緩慢，體積變小，胞質(zhì)渾濁，細(xì)胞周緣模糊，出現(xiàn)細(xì)胞間隙;C組HGC-27細(xì)胞間隙增大，體積縮小，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞生長緩慢，胞體皺縮，部分細(xì)胞破碎，總體呈分散懸浮生長，貼壁現(xiàn)象減弱甚至消失。

2.2 細(xì)胞遷移能力 劃痕實驗中培養(yǎng)24 h后，未經(jīng)木犀草素處理的HGC-27細(xì)胞運動遷移基本完全覆蓋了劃痕區(qū)域，而A、B、C組HGC-27細(xì)胞僅覆蓋了96.2%、72.3%、55.6%的劃痕區(qū)域。Transwell實驗中A、B、C組HGC-27細(xì)胞穿膜數(shù)量占對照組細(xì)胞穿膜數(shù)量的百分比分別為97.6%、59.5%、20.0%。

2.3 MMP-7的表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)木犀草素處理過的HGC-27細(xì)胞中MMP-7表達(dá)較對照組明顯降低，隨著木犀草素濃度的增加而減少，見圖1。

圖1 木犀草素對人胃癌HGC-27細(xì)胞中MMP-7表達(dá)水平的影響

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2000年資料統(tǒng)計，全球每年新發(fā)胃癌87萬例，占所有新發(fā)癌癥病例的9%，僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌，居第4位，每年約有64萬人因胃癌死亡，居癌癥死因的第2位［8］。胃癌的轉(zhuǎn)移仍然是外科手術(shù)治療的瓶頸。臨床研究統(tǒng)計表明［9］，約60%就診的腫瘤患者就診時已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，80%的患者最終要發(fā)展到腫瘤晚期階段，約8.6%的患者就診時周圍血中能查見癌細(xì)胞，76%患者在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的2 a內(nèi)死亡。

腫瘤的轉(zhuǎn)移過程機制和復(fù)雜伴隨著多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)［10］。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是研究比較多的一個。目前已知腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)展過程中的重要步驟，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。MMP-7又稱基質(zhì)溶解素，是金屬蛋白酶家族中最小的成員，可表達(dá)于多種組織的病理和生理過程中。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生且能夠活化其他MMPs成員如MMP-2、MMP-9等，還能滅活絲氨酸蛋白酶抑制劑［11］，因此推測MMP-7在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮直接作用。

我國是天然藥物大國，應(yīng)用中草藥治療腫瘤歷史悠久，現(xiàn)代藥理研究表明，木犀草具有抗腫瘤效果，可以通過抗增殖和誘導(dǎo)凋亡抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長，在體外對人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人子宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人結(jié)腸癌CaCO2細(xì)胞、人胃腺癌AGS細(xì)胞、人胃癌MGC-803細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞多種癌細(xì)胞有抑制增殖作用［12］，還可誘導(dǎo)一些癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，在HeLa細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞系DU145等人類惡性腫瘤細(xì)胞中，木犀草素能顯著上調(diào)死亡受體(DR5，也稱為TRAILR2)，引起細(xì)胞凋亡，并伴隨著Bcl-2-相互作用區(qū)域的剪切和Caspase-3、8、9、10的激活，而對正常細(xì)胞則沒有類似作用［13］。王煥等［14］采用小鼠自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移和被動轉(zhuǎn)移模型，通過檢測腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)及臟器指數(shù)來研究木犀草素對小鼠Lewis肺癌和4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示木犀草素可有效抑制小鼠Lewis和4T1肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，增強小鼠對癌癥的相伴免疫反應(yīng)，有明顯的抗轉(zhuǎn)移作用。

木犀草素對胃癌細(xì)胞遷移的研究國內(nèi)未見報道。本研究結(jié)果顯示木犀草素在10～40 μmol/L范圍內(nèi)對人胃癌細(xì)胞系HGC-27的增殖產(chǎn)生抑制作用，且呈濃度依賴性。40 μmol/L木犀草素作用24 h后對細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到55.6%，表明木犀草素在體外能夠有效的抑制胃癌細(xì)胞的增殖，Transwell實驗表明木犀草素對人胃癌HGC-27細(xì)胞的遷移有明顯的抑制作用，且其與用藥濃度呈正向相關(guān)。同時，遷移能力減弱細(xì)胞中細(xì)胞因子MMP-7的表達(dá)被強烈抑制。據(jù)此，我們推測木犀草素抑制人胃癌HGC-27細(xì)胞的遷移與其抑制細(xì)胞內(nèi)MMP-7的蛋白表達(dá)水平從而減少細(xì)胞外基質(zhì)大分子蛋白水解有關(guān)。

［1］范文輝，黃茂.木犀草素對哮喘小鼠氣道重塑的影響及機制探討［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10(9):647-649.

［2］呂立華，呂林華等木犀草素對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織的保護(hù)作用及 NF-κB表達(dá)的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22 (7):1645-1646.

［3］van Meeteren ME，Hendriks JJ，Dijkstra CD，et al.Dietar y compounds prevent oxidative damage and nitricoxide production by cells involved in demyelinating disease［J］.Biochem Pharmacol，2004，67(5):967.

［4］Wu WW，Liu BL，Tang N，et al，Topical application of luteolin inhibits dry skin prurius in mice［J］.Chin J Nat Med，2005，3 (3):1731.

［5］Yi L，Li Z，Yuan K，et al.Small molecules blocking the entry of severe acute respiratory syndrome coronavirus into host cells［J］.J Virol，2004，78(20):113341.

［6］Brusselmans K，Vrolix R，Verhoeven G，et al.Induction of cancer cell apoptosis by flavonoids is associated with their ability to inhibit fatty acid synthase activity［J］.J Biol Chem，2005，280(7): 5636.

［7］Shi RX，Ong CN，Shen HM.Protein kinase C inhibition of apoptosis protein degradation contribute to the sensitization effect of luteilin on tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand induced apoptosis in cencer cells［J］.Cancer Res，2005，65(17): 7815.

［8］徐飚，王建明.胃癌流行病學(xué)研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13(1):1-7.

［9］李佩文.中西醫(yī)臨床腫瘤學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1996:336.

［10］張筱茵，陳詠儀.胃癌局部細(xì)胞因子表達(dá)譜分析［J］.中華腫瘤雜志，2002，24(1):27.

［11］Parsons SL，Swatson SA，Brown PD，et al.Matrixmetalloproteinase［J］.BritSurg，1997，84(2):160.

［12］王洪燕.木犀草素抗腫瘤增殖及增敏抗腫瘤藥物作用研究［J］，浙江大學(xué)學(xué)報，2010，1(39):30-36.

［13］Horinaka M，Yoashida T，Shirai SHIT，et al.Luteolin induces apoptosis via death receptor 5 upregulation in human malignant tumor cells［J］.Oncogene，2005，24(48):7180-7189.

［14］王煥，王荔.木犀草素抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(22)1915-1917.