柯 金，胡喜梅，周水陽，包維鶯，范燕琴，陸 翠，朱銳鋒，王恒石，劉 媛

(上海市松江區(qū)中心醫(yī)院，上海201600)

最近研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤中存在具有自我更新特性的細胞亞群即腫瘤干細胞，是引發(fā)腫瘤并維持其生長的根源，并在腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移中起著決定性作用［1～5］。但結(jié)直腸癌組織中有無腫瘤肝細胞尚不明確。2011年8～11月，我們檢測了60例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的腫瘤干細胞標志物CD133和Ki67、survivin?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年6月～2011年6月本院和上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)院收治的60例結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌根治術切除腫瘤組織標本。其中男26例，女34例;平均年齡64歲。結(jié)腸癌34例、直腸癌26例;高分化腺癌10例、中分化腺癌43例、低分化腺癌7例;pTNM分期Ⅰ期11例、Ⅱ期20例、Ⅲ期26例、Ⅳ期3例?；颊咝g前均未行放化療。

1.2 CD133和Ki67、survivin檢測方法 采用Envi-sion兩步法檢測標本中 CD133、Ki67、survivin的表達。標本用石蠟包埋，制成4～5 μm厚切片;脫蠟、梯度水化;切片置于pH值為6.0檸檬酸緩沖液中進行煮沸處理10 min，室溫冷卻，PBS漂洗;分別滴加一抗CD133多克隆抗體、Ki67單克隆抗體、survivin單克隆抗體，37℃孵育1 h，PBS沖洗;加適當比例稀釋的二抗，37℃孵育20～30 min，PBS沖洗;DAB顯色;蘇木素復染，酒精梯度脫水，干燥，中性樹膠封片;顯微鏡觀察。以PBS替代一抗作為空白對照，以已知陽性切片為陽性對照。

每張切片隨機取5個高倍視野(×400)，分別計數(shù)100個細胞中陽性細胞數(shù)，取其平均值定義為該細胞的陽性細胞百分比。CD133為跨膜蛋白，定位于細胞膜及細胞質(zhì)，survivin定位于細胞質(zhì)或細胞核，Ki67定位于細胞核，以出現(xiàn)棕黃色高出背景色為陽性細胞。由于CD133陽性細胞數(shù)量較少，先在低倍光學顯微鏡下(×100)尋找細胞陽性區(qū)域，然后在高倍鏡下計數(shù)CD133陽性細胞數(shù)，其中無陽性細胞表達者定義為陰性(－)，有陽性細胞表達者定義為陽性(+)。survivin陽性細胞數(shù)＜10%為表達陰性(－)，陽性細胞數(shù)≥10%為表達陽性(+)。Ki67標記指數(shù)(Ki67 LI)以陽性細胞百分率表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Person法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

CD133主要定位于腫瘤細胞的腺腔面細胞膜，形成膜染色的環(huán)狀結(jié)構(gòu);少數(shù)可見單個腫瘤細胞胞質(zhì)染色。CD133陽性腫瘤細胞在結(jié)直腸癌中呈非均勻分布，通常聚集在一個或相鄰的幾個癌巢中，且僅僅限于與腺腔直接接觸的腫瘤細胞。在CD133陽性腺腔中的脫落細胞，通常CD133表達呈陽性。本組30例(50%)CD133陽性表達。CD133表達與結(jié)直腸癌組織的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(P＜0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤的部位及大小、侵襲深度無關(P均＞0.05)。詳見表1。

本組survivin陽性26例(43.3%)，Ki67 LI≥50%者41例(68.3%)。survivin僅與結(jié)直腸癌組織的病理分級有關(P＜0.05)，Ki67 LI與各項臨床病理參數(shù)無關(P均＞0.05)。詳見表1。

相關分析結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中CD133與survivin、Ki67呈正相關(r分別為0.269、0.466，P均＜0.05);survivin與Ki67呈正相關(r為0.378，P＜0.01)。

3 討論

表1 結(jié)直腸癌組織中CD133、survivin、Ki67與臨床病理參數(shù)的關系

傳統(tǒng)觀念認為，腫瘤是由體細胞經(jīng)過一系列隨機的多基因突變而成，突變后細胞的增殖能力加強、凋亡基因沉默，使的每個腫瘤細胞都可以無限制地生長。與此相反，近年來的研究卻顯示并非所有的腫瘤細胞都有相同的增殖潛力，僅有極少數(shù)稱之為腫瘤干細胞的細胞具有廣泛增殖、自我更新和多向分化的能力。

CD133又稱Prominin-1，含5個跨膜區(qū)和2個胞外區(qū)的糖蛋白，是Prominin家族中的一員，最初作為造血干/祖細胞的標志物［6］。2007年O'Brien等［7］發(fā)現(xiàn)CD133可作為結(jié)直腸癌干細胞的特異性標志物。將從7例結(jié)腸癌原發(fā)灶和10例轉(zhuǎn)移灶中分離的CD133陽性腫瘤細胞接種于NOD/SCID鼠腎被囊中，發(fā)現(xiàn)CD133陽性細胞可以起始腫瘤，而CD133陰性細胞不具有起始腫瘤的作用。由于CD133陽性細胞具有自我更新及分化、增殖能力，故認為CD133陽性細胞即結(jié)腸腫瘤干細胞。同樣在 WIDR、SW480、HSC15、CCK81等12株結(jié)腸癌細胞系中也發(fā)現(xiàn)了結(jié)腸腫瘤干細胞的存在［8］。目前CD133是多種腫瘤干細胞研究的熱點標志物之一，但其具體功能尚待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌標本中CD133陽性表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期和病理分級顯著相關，即腫瘤組織中CD133陽性細胞越多，其發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性就越大，腫瘤的侵襲能力和惡性程度就越高，患者的術后生存時間可能就越短。提示腫瘤組織中CD133陽性細胞越多，腫瘤干細胞就越多，術后殘留的腫瘤干細胞通過自我更新和多向分化，導致腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移。同樣，大量研究顯示CD133可作為結(jié)直腸癌患者的獨立預后因子，CD133表達與患者的無復發(fā)生存和總生存率呈負相關，與腫瘤的進展和肝轉(zhuǎn)移呈正相關［9～11］。

survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)的分子量最小，對凋亡的抑制作用最強的IAP。基因長度為14.7 kb，定位于染色體17q25，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。survivin具有抑制細胞凋亡的生物學功能，通過抑制內(nèi)源性和外源性凋亡途徑細胞色素C和Caspase-8誘導的Caspases活化，或直接同Caspase-3和Caspase-7結(jié)合使級聯(lián)終止，以實現(xiàn)對細胞凋亡的抑制。研究顯示survivin在人類多種腫瘤組織中過表達，而在成人正常分化的組織中很少表達，并且survivin的表達與惡性腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、化療耐藥性及預后相關［12］。本研究顯示結(jié)直腸癌組織中survivin表達與腫瘤病理分級密切相關，并且和CD133表達正相關，提示survivin的過表達可能在腫瘤干細胞的化療抵抗性中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在復發(fā)的惡性膠質(zhì)瘤中，耐藥性和放療抵抗性的增加是由于腫瘤干細胞的BCRP1、MGMT和survivin表達增強所致［13］。

Ki67是一個和細胞增殖有關的核抗原，Ki67蛋白是一種分子量為345、395 kd的雙鏈非組蛋白分子。Ki67存在于細胞周期的G1后期、S、G2、M期，而不存在靜止的G0細胞。Ki67表達能可靠而迅速的反映惡性腫瘤增殖率，與多種惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預后有關，是應用最廣泛的增殖細胞標志之一。本研究顯示結(jié)直腸癌組織中CD133和survivin的表達與Ki67的表達呈正相關，提示腫瘤干細胞數(shù)量越多，腫瘤增殖率越高。國內(nèi)唐畢鋒等［14］用RT-PCR檢測38例手術切除的胃癌原發(fā)組織中CD133mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)CD133mRNA的表達與Ki-67表達密切相關。李亞卓等［15］應用組織芯片技術檢測336例胃癌術后標本中CD133和Ki-67的表達，發(fā)現(xiàn)兩者的表達呈正相關。

總之，結(jié)直腸癌中CD133陽性細胞，即腫瘤干細胞，在腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，檢測腫瘤干細胞標志物CD133的表達對判斷結(jié)直腸癌的惡性程度和預后具有積極的臨床意義。

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