高春花，汪俊云，楊玥濤，石 鋒，朱慧慧，焦 偉

人囊型棘球蚴病又稱囊型包蟲病，是由細粒棘球絳蟲的幼蟲寄生所致，是一個重要的世界性公共衛(wèi)生問題。我國西部是世界上包蟲病患病率最高的地區(qū)，包蟲病是當前我國危害最嚴重的寄生蟲病。目前，對包蟲病的診斷主要依賴影像學方法，但該法不能進行早期診斷，造成患者錯過最佳藥物治療期，因此，需要尋求簡便高效的免疫學方法，抗原的選擇是影響免疫學方法檢測效能的關鍵。迄今，已對多種抗原進行了評價，但結(jié)果差異很大［1－3］。本文對多種抗原，包括羊細粒棘球蚴純化包囊液粗抗原（Hydatid cyst fluid，HCF）、天然抗原B （Antigen B，AgB）及從我國新疆源細粒棘球蚴原頭節(jié)克隆表達的 AgB亞基（AgB8／1、AgB8／2和 AgB8／3）檢測囊型包蟲病的性能進行比較，以期篩選出較為理想的抗原應用于免疫學方法檢測我國的囊型包蟲病。

1 材料與方法

1．1 血樣 手術確診細粒棘球蚴病人血清87份，分別由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預防控制中心（44份）、甘肅省疾病預防控制中心（43份）提供。20份手術確診多房棘球蚴病人血清由寧夏區(qū)疾病預防控制中心惠贈。囊尾蚴病病人血清25份、血吸蟲病病人血清12份、弓形蟲病人血清10份、衛(wèi)氏并殖吸蟲病人血清8份和華支睪吸蟲病病人血清9份為本所血清庫提供，上海市健康人血清60份。

1．2 試劑與試劑盒 TRIzol（Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（北京索萊寶公司），內(nèi)切酶EcoRI，BamHI（Fermentas）pGEX－3X載體（Amersham），DH5α感受態(tài)細胞和BL21（DE3）感受態(tài)細胞（TIANGEN），質(zhì)粒抽提試劑盒（OMEGA），谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂（GE healthcare），蛋白酶Factor Xa（Amersham），羊抗人IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物（Invitrogen），3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）（TIANGEN）。

1．3 純化HCF和天然AgB的制備按參考文獻［1］進行。

1．4 AgB三個亞基克隆表達和重組抗原的純化?。?0℃凍存的新疆源細粒棘球蚴原頭節(jié)，按說明書用TRIzol法提取總RNA，采用RT－PCR方法擴增目的基因片段。引物序列與擴增條件見參考文獻［4］。PCR產(chǎn)物與pGEX－3X載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將含有正確插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單一菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1mmol／L IPTG，28℃ 誘導表達4h［5］。

用谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂親和純化重組蛋白后用蛋白酶Factor Xa將融合蛋白的GST切下，測目的蛋白濃度后－30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 ELISA 參照文獻［6］并做適當調(diào)整。簡言之，純化HCF包被量為1μg／孔，nAgB包被量為0．25 μg／孔，重組抗原的包被量為0．3μg／孔。血清樣本的稀釋度為1∶200。羊抗人IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物的工作濃度為1∶30 000，加入TMB底物顯色后在450nm波長處測定吸光度（A）值。以60個非疫區(qū)健康人血清的A450均值加3個標準差（x＋s）定為陽性閾值，每份血清做兩個孔，受檢樣本的A450平均值等于或大于閾值者判為陽性。

1．6 統(tǒng)計學分析 敏感度、特異度和診斷效能的計算方法按文獻［7］進行。采用Excel 2000進行統(tǒng)計分析，各種抗原檢測結(jié)果用χ2檢驗進行分析。

2 結(jié) 果

2．1 AgB三個亞單位基因的克隆表達 以我國新疆源細粒棘球絳蟲分離株原頭節(jié)材料用RT－PCR方法成功獲得AgB8／1，AgB8／2和AgB8／3的基因片段，片段長度分別為213、258和243個堿基，推測分別編碼的氨基酸個數(shù)為71個、86個和81個。推導的氨基酸序列如下：AgB8／1（VVVTQADDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQKVVDL LKELEEVFQLLRKKLRMALRSHLRGLIAEGE）；AgB8／2（TYILLSLALVAFVAVVQAKDEPKAH MGQVVKKRWGELRDFFRNDPLGQRLVALGN DLTAICQKLQLKIREVLKKYVKNLVEEKDDD）和AgB8／3（ALA LVSFVVVAHADDDDDEVTKT KKGVMKAISEIKHFFQSDPLGKKLVEVMKDV ASVCEMVRKKARMALKEYVRKLVKEDE）。用蛋白酶Factor Xa將AgB8／1，AgB8／2和AgB8／3融合蛋白的GST切下，見圖1。

2．2 ELISA 以制備的純化 HCF、nAgB 、rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3為包被抗原，檢測87份囊型包蟲病患者血清、20份泡型包蟲病患者血清、64份其它，結(jié)果見表1、2。

圖1 pGEX－3X－AgB三個亞基融合蛋白表達及純化的16%SDS－PAGE鑒定M：標準蛋白分子量；1：未誘導的PGEX－3X空質(zhì)粒；2：經(jīng)IPTG誘導的PGEX－3X空質(zhì)粒；3，7，11：未誘導的PGEX－3X－AgB8／1，2，3；4，8，12：經(jīng)IPTG誘導的PGEX－3X－AgB8／1，2，3；5，9，13：PGEX－3X－AgB8／1，2，3融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖4B樹脂純化后；6，10，14：PGEX－3X－AgB8／1，2，3 融 合 蛋 白 經(jīng) 蛋 白 酶Factor Xa消化后Fig．1 SDS－PAGE （16%）analysis of three pGEX－3X－AgB subunits expressed in E．coli BL21cellsM：Molecular marker；1：pGEX－3Xempty vector before induction；2：pGEX－3Xempty vector after induction；3，7，11：pGEX－3X－AgB8／1，2，3whole cell without IPTG induction；4，8，12：soluble fractions of pGEX－3X－AgB8／1，2，3with IPTG induction after cellular disruption；5，9，13：purified pGEX－3X－AgB8／1，2，3fusion protein；6，10，14：pGEX－3X－AgB8／1， 2， 3after digestion by Factor Xa．

3 討 論

本文應用純化 HCF、nAgB、rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3抗原作為包被抗原，用ELISA法檢測了87份囊型包蟲病患者和84份非囊型包蟲病患者和60份健康人血清中特異抗體，結(jié)果表明天然抗原（純化的HCF和nAgB）檢測的敏感度高于重組抗原（rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3）（P＜0．05）；而3個重組抗原中rAgB8／2檢測的敏感度高于rAgB8／1、和rAgB8／3（P＜0．05）；純化 HCF 與nAgB、rAgB8／1、rAgB8／2和rAgB8／3診斷的特異度之間均無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）?？傮w診斷性能也是兩種天然抗原優(yōu)于重組抗原，這與其他作者的研究結(jié)果一致［6］。

迄今免疫學方法檢測囊型包蟲病仍以天然的細粒棘球蚴包囊液粗抗原敏感度最高，但由于囊液中成分復雜，既有蟲體本身的代謝分子，又有宿主的代謝物（主要是白蛋白和免疫球蛋白），且來源相異，不易標準化［8］。AgB是細粒棘球蚴包囊液中含量最豐富的組分之一，是目前免疫檢測囊型包蟲病最有前景的組分抗原。AgB是由數(shù)個約8kDa的亞基組成的多聚體，目前，已知至少有5個亞基組成了AgB，即EgAgB1，EgAgB2，EgAgB3，EgAgB4，和 EgAgB5［3，9］，EgAgB1和 EgAgB2重組蛋白應用于囊型包蟲病的診斷已有廣泛研究，EgAgB2顯示了很好的診斷效能［10］，這與本課題組前期的研究結(jié)果一致［5］。

表1 5種抗原檢測囊型包蟲病患者血清和對照血清陽性率［%（陽性數(shù)／檢查數(shù)）］Tab．1 Results of sera examined by ELISA with five antigens

表2 5種抗原ELISA檢測囊型包蟲病患者血清的診斷性能Tab．2 Diagnostic performance of the five Echinococcus granulosus antigens

結(jié)果表明，無論是天然抗原還是重組抗原均與泡型包蟲病人血清存在不同程度的交叉反應（45%～90%），與其他作者的研究結(jié)果一致［11］。事實上，細粒棘球絳蟲AgB各個亞基的同源物均存在于多房棘球絳蟲中，各亞基的同源物無論在基因序列還是其編碼的氨基酸序列水平上均顯示非常高的同源性（達90%左右）［9］，這就解釋了血清學檢測中兩者存在較多交叉反應的原因。本次研究中的所有抗原與囊尾蚴病人、血吸蟲病人、肝吸蟲病人、肺吸蟲病人和弓形蟲病人血清也存在不同程度的交叉反應。其中，天然抗原（純化HCF和nAgB）與囊尾蚴病人血清的交叉反應較多，因為二個蟲種之間具有共同的抗原表位［2］。

5種抗原中純化的天然抗原和rAgB8／2對人囊型包蟲病診斷效能較高，但它們檢測的敏感度和特異度仍有很大局限，不能滿足診斷需要，因此，迫切需要篩選出診斷效能更高的新抗原以滿足診斷囊型包蟲病之需。

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