王 政，王小英，馬文麗，李孟森

狂犬病是一種嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物健康的重要人獸共患病，至今無(wú)有效地治療藥物，一旦發(fā)病即引起100%的死亡。近年來(lái)，我國(guó)狂犬病疫情一直呈上升趨勢(shì)，病死數(shù)據(jù)居我國(guó)37種法定報(bào)告?zhèn)魅静≈祝?］。

為了預(yù)防狂犬病并研制高效安全的狂犬病疫苗，人們不斷地進(jìn)行研究和探索，Tao L等利用反向遺傳學(xué)把兩組狂犬病毒糖蛋白（G）基因通過(guò)雞胚傳代得到滅活的狂犬病毒疫苗［2］?？诜呙缡茄芯康男骂I(lǐng)域，即利用消化道吸收含有治療性的核酸，經(jīng)消化道到達(dá)特定部位分泌出治療性蛋白，發(fā)揮治療功能，從而達(dá)到防治狂犬病的作用。

目前研究狂犬病毒某個(gè)蛋白的表達(dá)情況較多是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然表達(dá)量高，但具有致病性，不適合用于藥物研發(fā)。相比之下，釀酒酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)卻具備有安全無(wú)致病性，易遺傳操作、有良好的蛋白分泌能力、有類似高等生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)［3］，成為一種良好的藥物蛋白表達(dá)載體。此外，釀酒酵母特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)消化道的胃酸有較強(qiáng)的抵抗作用，是一種天然的生物膠囊，能為生物大分子提供良好的保護(hù)，同時(shí)釀酒酵母細(xì)胞壁所含有的成分可調(diào)節(jié)腸胃功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，是一種良好的保健食品來(lái)源［4］。由此可見(jiàn)釀酒酵母完全有可能作為外源物質(zhì)的天然緩釋包裹物，在消化道給藥過(guò)程中起長(zhǎng)效作用。

本研究以釀酒酵母為微生物輸送載體，以狂犬病毒核蛋白（N）和糖蛋白（G）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)連接核蛋白和糖蛋白，并構(gòu)建分泌型表達(dá)載體，表達(dá)出具有免疫原性的蛋白，為今后的口服疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 SAD－B19弱毒株編碼GP和NP的基因（質(zhì)粒pVax－G）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良博士惠贈(zèng)；釀酒酵母INVScI、酵母表達(dá)載體pYes2由南方基因研究所惠贈(zèng)；E．coli的DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。ExTaq酶pMD－18T載體和EcoRI、PstI、XbaI、NheI等限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自Takara（大連）公司。T4DNA連接酶購(gòu)自Promege公司，DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Ladder購(gòu)于北京天根生化科技有限公司?？袢〔《镜男∈髥慰寺】贵w（1C5）購(gòu)自Abcam；羊抗鼠IgG購(gòu)自Bioworld。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 pMD18－T／G／N融合基因克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

1．2．1．1 PCR 擴(kuò)增 G／N 基因片段：根據(jù) Sambrook［5］等試驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作方法，確定PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件。PCR法從質(zhì)粒pVax－G中擴(kuò)增狂犬病病毒G基因。上游引物為5′－CCGGAATTCATGGTTCCTCAGGCTCTC－3′（下劃線部分為EcoRI酶 切 位 點(diǎn) ），下 游 引 物5′－GGCCTGCAGCAGTCTGGTCTCACCCCCACTCTTG－3′（下劃線部分為PstI酶切位點(diǎn)），反應(yīng)體積50μL，30個(gè)循環(huán)：94℃90s，58℃90s，72℃120s。目的片段以EcoRI、PstI酶切回收純化備用。PCR法從質(zhì)粒pVax－G中擴(kuò)增狂犬病病毒N基因。上游引物為5′－GCCCTGCAGGATGCCGACAAGATTGTATTC－3′（下劃線部分為PstI酶切位點(diǎn)），下游引物5′－TGCTCTAGATTATGAGTCACTCGAATA TGTCT－3′（下劃線部分為XbaI酶切位點(diǎn)），反應(yīng)體積50μL，30個(gè)循環(huán)：94℃90s，58℃90s，72℃120s。目的片段以PstI、XbaI酶切回收純化備用。

1．2．1．2 線 性 pMD18－T 的 制 備 克 隆 質(zhì) 粒pMD18－T以EcoRI和XbaI酶切，回收線性載體片段。

1．2．1．3 融合基因的制備 將PCR擴(kuò)增的G、N基因酶切后的回收產(chǎn)物，在T4DNA連接酶的作用下融合，回收融合片段。

1．2．1．4 融合片段與克隆質(zhì)粒pMD18－T 連接將融合片段與pMD18－T載體在16℃條件下過(guò)夜連接，獲得克隆質(zhì)粒。反應(yīng)體積10μL（融合片段7μL，pMD18－T 1μL，T4DNA 連接酶1μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1μL）常規(guī)CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，以氨芐抗性篩選，菌落酶切鑒定重組陽(yáng)性克隆，將鑒定正確的克隆各送3個(gè)至北京天根公司測(cè)序，抽提構(gòu)建成功的克隆質(zhì)粒。

1．2．2 融合基因分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

1．2．2．1 融合基因片段的獲取 取克隆成功的pMT－G／N融合基因克隆質(zhì)粒，以EcoRI和XbaI酶切，回收G／N融合基因。

1．2．2．2 線性分泌表達(dá)載體的制備 表達(dá)載體pYes2以EcoRI和XbaI酶切，回收線性表達(dá)載體。將融合基因片段與分泌表達(dá)載體pYes2 16℃連接過(guò)夜。獲得成功連接融合基因的分泌表達(dá)質(zhì)粒。反應(yīng)體積10μL（融合片段7μL，pYes2 1μL，T4DNA連接酶1μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1μL），鑒定方法如1．2．1．4；抽提構(gòu)建成功的攜帶融合基因的分泌表達(dá)質(zhì)粒pYes2－G／N。

1．2．3 pYes2－pVax－G／N 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母 常規(guī)醋酸鋰法轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型（SC－U）培養(yǎng)基初次篩選，提取經(jīng)初次篩選的陽(yáng)性克隆酵母質(zhì)粒，PCR鑒定為陽(yáng)性重組酵母。

1．2．4 pYes2－pVax－G／N 在釀酒酵母中的誘導(dǎo)表達(dá) 將酵母陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接至15mL液體SC－U培養(yǎng)基（含2%的葡糖糖）中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)OD600＝2．2，取10mL培養(yǎng)物4℃3 000r／m離心5min，去上清，加1mL SC誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含2%半乳糖）重懸菌體，并轉(zhuǎn)移至50mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，使最終OD600約為0．4，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12h，取10mL菌液，高速離心，收集上清，至上清中加入5倍體積預(yù)冷丙酮，靜置1h，4℃離心，去上清，往沉淀中加入7mol／L鹽酸胍0．5mL復(fù)性30min，分裝，－80℃保存?zhèn)溆糜赟DS－PAGE電泳。

1．2．5 Western－blot分析 以12%分離膠進(jìn)行SDS－PAGE電泳，以誘導(dǎo)前菌株為陰性對(duì)照，狂犬病病毒的小鼠單克隆抗體（1C5）1∶2 000和辣根過(guò)氧化物酶山羊抗小鼠IgG 1∶5 000進(jìn)行 Westernblot分析。

2 結(jié) 果

2．1 G和N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果從質(zhì)粒pVax－G中PCR擴(kuò)增出G、N基因，1%瓊脂糖凝膠電泳，以DGL500為Marker，得到位于1 000～2 000之間的G、N兩條目的帶，G基因的片段為1 518bp，N基因片段為1 353bp，見(jiàn)圖1。

圖1 G、N基因的PCR結(jié)果1：G基因；2：N基因；M：DNA markerFig．1 PCR detection on the existence of G and N genes1：G gene；2：N gene；M：DNA Marker．

2．2 G和N基因的融合 將G、N基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用PstI內(nèi)切酶酶切4h，DNA膠回收后，相同濃度等量加入到反應(yīng)體系中，以T4DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，以1kb為Marker，連接產(chǎn)物電泳，在2 928bp處存在一條預(yù)期的條帶，如圖2。

圖2 PCR檢測(cè)狂犬病病毒G／N融合基因酶切電泳圖Fig．2 Result of PCR production of G／N gene digested by endoenzymeM：DNA Marker；1：G／N fused gene．

2．3 融合片段與與克隆質(zhì)粒pMD18－T連接 將融合片段與pMD18－T載體在16℃條件下過(guò)夜連接，獲得克隆質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取3個(gè)菌落以內(nèi)切酶EcoRI、XbaI和NheI酶切鑒定，并送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。酶切如圖3。

2．4 pYes2－pVax－G／N 質(zhì)粒載體的鑒定 pYes2與pVax－G／N融合基因連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以擴(kuò)增G／N融合基因的引物進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果中出現(xiàn)2871bp的特異性條帶即為目的基因，對(duì)應(yīng)菌落即為陽(yáng)性克隆，如圖4，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與理論值完全相符。

2．5 酵母陽(yáng)性克隆子的鑒定 pYes2－pVax－G／N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母，SC－U培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性克隆，提取該陽(yáng)性酵母克隆質(zhì)粒，PCR進(jìn)一步鑒定，如圖5。

2．6 pYes2－pVax－G／N 質(zhì)粒誘導(dǎo)的表達(dá)結(jié)果 收集上清液，經(jīng)變性復(fù)性處理后，SDS－PAGE鑒定重組釀酒酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果在約110kD處有一條與對(duì)照不同的條帶出現(xiàn)，但該條帶是否為目標(biāo)蛋白，能否與狂犬病病毒單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)還需通過(guò) Western－blot進(jìn)一步鑒定確定，如圖6A；Western－blot分析結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的上清液約在110kD處有一特異性條帶，據(jù)此可判定狂犬病毒pYes2－pVax－G／N融合基因在釀酒酵母中獲得分泌表達(dá)，且目標(biāo)蛋白具有良好的抗原性，如圖6B。

3 討 論

據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)全球約有五萬(wàn)五千人死于狂犬病［6］，而全球約有一千萬(wàn)狂犬病疫苗用于暴露后治療，其中約48%的疫苗仍然來(lái)源于具有潛在危險(xiǎn)的腦組織減毒疫苗。

狂犬病病毒（Rabies virus，Rv）屬?gòu)棤畈《究瓶袢〔《緦?，其基因組為12kb的單股負(fù)鏈RNA，編碼5種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即核蛋白（N）、轉(zhuǎn)錄酶蛋白（L）、基質(zhì)蛋白（M）、磷酸化蛋白（NS）和糖蛋白（G）［7］。其中糖蛋白（GP）和核蛋白（NP）是Rv可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的兩種主要蛋白質(zhì)。GP可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體［8］，NP與抗狂犬病病毒的免疫識(shí)別和記憶有關(guān)，NP可以激活B細(xì)胞的抗體反應(yīng)，誘發(fā)補(bǔ)體結(jié)合抗體，促進(jìn)中和抗體產(chǎn)生，抑制病毒在細(xì)胞間的傳播和在細(xì)胞內(nèi)繁殖。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，NP與抗狂犬病病毒的免疫識(shí)別和記憶有關(guān)。在以GP為目的抗原進(jìn)行抗狂犬病的研究中，發(fā)現(xiàn)GP是Rv當(dāng)中重要的一種抗原蛋白，具有6個(gè)～7個(gè)抗原表位，其中Ⅱ和III是重要的抗原表位［9］Tomar NR等［10］為了研究表位疫苗預(yù)防狂犬病，利用巨細(xì)胞病毒表達(dá)狂犬病毒GP，并利用免疫印跡和間接免疫熒光技術(shù)等方法預(yù)測(cè)其抗原表位。

在研究狂犬病疫苗領(lǐng)域，表達(dá)抗原性蛋白最初用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)雖然表達(dá)產(chǎn)量高，但原核表達(dá)系統(tǒng)不具有修飾功能，且表達(dá)產(chǎn)物具有致病性，所以不適合用于藥物研發(fā)。后來(lái)Osorio等和Henderson等分別在痘苗病毒和腺病毒中表達(dá)抗原性蛋白，雖然能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但是這兩種病毒作為載體的同時(shí)存在潛在的致病性［11］。相比之下，釀酒酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)卻具備有安全無(wú)致病性，易遺傳操作、有良好的蛋白分泌能力、有類似高等生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)［3］，成為一種良好的藥物蛋白表達(dá)載體。同時(shí)作為口服疫苗的輸送載體，釀酒酵母細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，其細(xì)胞外層為甘露聚糖，中間層為蛋白質(zhì)分子，內(nèi)層為葡聚糖，因此該酵母對(duì)消化道的胃酸作用具有較強(qiáng)的抵抗作用，是一種天然的生物膠囊。它具備其他微生物所不具有的優(yōu)勢(shì)［12］，如增強(qiáng)免疫能力，具有抗輻射、抗腫瘤、抗炎和調(diào)節(jié)胃腸功能的作用。由此可見(jiàn)，釀酒酵母是一種很好的藥物表達(dá)載體。

糖蛋白（GP）和核蛋白（NP）是Rv可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的兩種主要蛋白質(zhì)。為了研制高效、安全的狂犬病疫苗，本研究通過(guò)基因工程方法將編碼GP和NP的狂犬病病毒基因進(jìn)行融合，構(gòu)建狂犬病糖／核蛋白融合基因真核表達(dá)載體，利用釀酒酵母表達(dá)目的蛋白，最后通過(guò)SDS－PAGE和Western－blot驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)先后的蛋白表達(dá)有一條明顯差異條帶，約110kD。由此可知，已經(jīng)成功構(gòu)建狂犬病病毒糖蛋白及核蛋白的融合表達(dá)體系，并成功分泌出目的蛋白，且具有良好的抗原性。

本實(shí)驗(yàn)采用釀酒酵母表達(dá)狂犬病病毒蛋白，在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有較好的抗原性，另外利用釀酒酵母作為載體不會(huì)對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生危害，生產(chǎn)和使用過(guò)程安全，可以大批量的生產(chǎn)抗原。通過(guò)上述的研究，為后續(xù)的口服狂犬病疫苗的制備和應(yīng)用提供充足的理論依據(jù)和研究條件。

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