聶 鑫，高 原

糞腸球菌是一種新的人獸共患病病原體［1］，它不但是引起醫(yī)院內(nèi)病人感染和死亡的主要致病菌［2］，而且動物感染糞腸球菌發(fā)病和死亡的報(bào)道也越來越多［3］。豬源糞腸球菌毒力島基因與人源相關(guān)基因、致羔羊腦炎糞腸球菌毒力因子基因片段與醫(yī)學(xué)臨床中某些該菌的相關(guān)基因片段同源性很高，存在著基因水平轉(zhuǎn)移或某種聯(lián)系［4－5］。糞腸球菌感染致死主要由其毒力因子所致。在糞腸球菌感染過程中，是由Ace介導(dǎo)黏附在宿主細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白上，完成定植和感染第一步的［6］。因此，Ace是糞腸球菌感染的最重要的毒力因子之一。

1 材料與方法

1．1 菌株與載體 所用糞腸球菌TLME3株為本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)生敗血癥的雛鵝體內(nèi)分離并鑒定；E．coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18－T克隆載體購于大連Takara公司。

1．2 工具酶及試劑Taq酶購自Promega公司，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、Proteinase K購于大連Takara公司，dNTPs、DNA DL2 000Marker、DNA DL10 000Marker、Solarbio凝膠回收試劑盒購自上海Solarbio生物科技公司，北京莊盟質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的糞腸球菌B－343／TX2783株（注冊號為 AF260896）的 AceA基因序列，用Primer Premier 5．6．0和 Oligo 6．71軟件設(shè)計(jì)1對引物，引 物 序 列 為：上 游 引 物 P1（BamH Ⅰ ）：5′－CGCGGATCCAGATCACACTACT－3′，下游引物 P2（XhoⅠ）：5′－，由大連 Takara公司合成。

1．4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：ddH2O 14．3μL，10×PCR buffer1．5μL，2．5mmol／LdNTP 2．0μL，上、下游引物各2．0 μL，模板DNA3．0μL，TaqDNA Polymeras 0．2μL，總體積25μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，5min；94 ℃，1min；52 ℃，1 min；72℃，1min；共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．5 PCR產(chǎn)物的克隆和測序 用Solarbio凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于鋪有IPTG（0．1mol／L）和X－Gal（0．05mol／L）的LB的平板上，37℃培養(yǎng)過夜。進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取生長良好的白色單個(gè)菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，用北京莊盟質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行BamH I、XhoI單、雙酶切鑒定和PCR鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pMD18－T－AceA。篩選陽性重組質(zhì)粒送大連Takara公司測序。

1．6 結(jié)構(gòu)和序列分析 用Lasergene7．0及ANTHEPROT本地軟件對糞腸球菌TLME3株AceA蛋白序列的組分、分子質(zhì)量、滴定曲線與等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；用Gene Runner軟件，對TLME3株AceA蛋白序列一級結(jié)構(gòu)中糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和硫酸化位點(diǎn)等修飾位點(diǎn)和模序進(jìn)行預(yù)測；用同源建模服務(wù)器SWISS－MODEL在線軟件，對TLME3株AceA蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。用NCBI上BLASTn和BLASTp在線軟件對糞腸球菌TLME3株AceA基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索；用Lasergene7．0中MegAlign程序，將測定的TLME3株AceA基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列，與用BLAST在線軟件搜索得到的其他糞腸球菌AceA氨基酸序列進(jìn)行多重比對，并用MEGA4．0軟件Phylogeny程序 Maximum Parsimony（MP）方法生成系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹；根據(jù)序列比對結(jié)果計(jì)算TLME3株AceA氨基酸序列的變異率。

2 結(jié) 果

2．1 目的基因的擴(kuò)增 以糞腸球菌TLME3株DNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)大小約957bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖1。

圖1 糞腸球菌TLME3株AceA基因的PCR擴(kuò)增M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；S1：TLME3AceA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；S2：ATCC29200AceA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．1 PCR amplification of AceA gene from E．faecalis strain TLME3M：DL2000DNA Marker；S1：Amplified Product of AceA from TLME3by PCR；S2：Amplified－Product of ATCC29200AceA by PCR

2．2 重組質(zhì)粒的鑒定 將糞腸球菌TLME3株陽性重 組 質(zhì) 粒 pMD18－T－AceA 進(jìn) 行 PCR 鑒 定、BamH I單酶切鑒定和BamH I、XhoI雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。圖2中3 649bp的單酶切條帶是pMD18－T－AceA全長序列，2 692bp和957bp的雙酶切條帶分別是載體條帶和目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明目的片段已經(jīng)成功地與克隆載體連接。

陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果TLME3株AceA基因核苷酸長957bp，用Lasergene7．0EditSeq程序查找的閱讀框?yàn)?18bp，編碼306個(gè)氨基酸。將TLME3株AceA基因序列錄入GenBank中，登錄號為：JQ726492。

2．3 結(jié)構(gòu)和序列分析

2．3．1 編碼蛋白理化特性及一級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測用Lasergene7．0對TLME3株AceA蛋白組分、分子質(zhì)量、滴定曲線和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

AceA含有19種氨基酸，其中Thr最多，其次為Glu和Asn，疏水性氨基酸Ala、IIe、Leu、Pro、Val和Trp共82個(gè)，占總數(shù)的26．8%；分子質(zhì)量為36．09kD；滴定曲線上等電點(diǎn)為4．32，表明AceA是酸性蛋白。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18－T－AceA單、雙酶切鑒定M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；S1：重組質(zhì)粒單酶切；S2：重組質(zhì)粒雙酶切Fig．2 Identification of pMD18－T－AceA by double restriction enzymes digestionM：DL10，000DNA Marker；S1：The product from pMD18－T－AceA digested with BamH I；S2：The product from pMD18－T－AceA digested with BamH I and XhoI

用Gene Runner軟件預(yù)測的TLME3株AceA蛋白一級結(jié)構(gòu)中，含有3個(gè)N糖基化位點(diǎn)、4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)N肉豆蔻?；稽c(diǎn)和11個(gè)酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。

用同源建模服務(wù)器SWISS－MODEL在線軟件預(yù)測的TLME3株AceA蛋白的三級結(jié)構(gòu)，與搜索到的其他菌株AceA蛋白的3級結(jié)構(gòu)同源性為98．63%，e值為5．94197e－68，可信度很大。

2．3．2 核苷酸及編碼氨基酸序列同源性和變異性分析 用BLASTn搜索出58個(gè)核苷酸同源序列，其中同源性為100%的序列1個(gè)、99%的序列20個(gè)、98%的序列34個(gè)、97%的序列3個(gè)；E值全部為0。用BLASTp搜索出84個(gè)氨基酸同源序列，其中同源性為100%的序列1個(gè)、99%的序列10個(gè)、98%的序列53個(gè)、97%的序列17個(gè)，96%的序列3個(gè)；E值也全部為0。細(xì)菌分離時(shí)間為1999年－2012年，來源為醫(yī)學(xué)臨床和人，分離地點(diǎn)為美國Houston和波蘭Warsaw。

用Lasergene7．0軟件 MegAlign程序Jotun Hein Method方法進(jìn)行核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列比對，表1是根據(jù)序列比對結(jié)果列出的TLME3株AceA氨基酸及核苷酸變異情況。

表1 糞腸球菌TLME3株AceA基因核苷酸及編碼氨基酸的變異情況Tab．1 Variation situation of nucleotide and amino acid coded by AceA gene fromE．faecalis strain TLME3

用 MEGA 4．0MP方法構(gòu)建的TLME3株AceA氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖3。

3 討 論

本試驗(yàn)中PCR擴(kuò)增、pMD18－T－AceA重組質(zhì)粒PCR鑒定、pMD18－T－AceA重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定、AceA基因序列測定等結(jié)果顯示，成功克隆了糞腸球菌TLME3株AceA基因。通過核苷酸序列分析，證實(shí)插入序列與靶基因一致，閱讀框正確，長度為918bp，編碼306個(gè)氨基酸。為在原核細(xì)胞中表達(dá)糞腸球菌TLME3株AceA蛋白進(jìn)而對其功能進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。

BLAST是由NCBI推出的搜索核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)庫的最基本工具，它集速度、敏感性、彈性與統(tǒng)計(jì)處理的最佳結(jié)合于一身；在報(bào)告統(tǒng)計(jì)結(jié)果時(shí)除了顯示相似性以外，也描述相似片段出現(xiàn)的可能性－E值；是當(dāng)前最受歡迎的搜索程序之一。本研究用BLASTn搜索出的同源序列與糞腸球菌TLME3株AceA基因核苷酸序列高達(dá)97%～100%的同源性和E值全部為0的結(jié)果表明，糞腸球菌AceA基因很保守，靶序列與同源序列肯定是同源基因。58個(gè)序列中，除了3個(gè)來源不明外，其余55個(gè)均來自于醫(yī)學(xué)臨床。目前還沒有在Gen－Bank注冊的動物源糞腸球菌AceA基因核苷酸序列。

圖3 TLME3株AceA氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig．3 Phylogenetic tree based on the protein of AceA from the strain TLME3

在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹上，糞腸球菌TLME3株AceA與用BLASTp搜索到的84個(gè)蛋白質(zhì)序列處于一個(gè)分支的2個(gè)節(jié)點(diǎn)上，表明它們來源于共同的祖先；與AAG23949處在同一位點(diǎn)上，同源性為100%；與ZP05569670、ZP07552605、ADN03976及AAG23952遺傳距離最近，在一個(gè)小分支上，同源性為99%；與其余79個(gè)序列遺傳距離也較近，同源性在96%～99%之間。

在本試驗(yàn)克隆的糞腸球菌TLME3株AceA基因閱讀框核苷酸序列918個(gè)堿基中，有12個(gè)堿基變異，變異率為1．31%。其中只有6個(gè)核苷酸變異引起了編碼的5個(gè)氨基酸發(fā)生了變異〔113G→T（2）和114C→T（3）是編碼同一氨基酸的2個(gè)堿基〕，變異率為1．63%。在進(jìn)化過程中，蛋白質(zhì)序列較DNA序列更為保守，所以采用蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性搜索更有意義。蛋白質(zhì)序列搜索、系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹構(gòu)建和變異率計(jì)算結(jié)果都表明，糞腸球菌AceA基因很保守，具備保守性這個(gè)動物糞腸球菌性傳染病診斷及保護(hù)性抗原候選基因的關(guān)鍵條件。

糞腸球菌Ace是分泌在菌體外的表面蛋白，具有IgG樣折疊結(jié)構(gòu)，可能具有免疫活性［7］。目前國內(nèi)外的試驗(yàn)證明了來源于人的糞腸球菌Ace蛋白對實(shí)驗(yàn)動物（兔、小鼠）具有免疫活性［8－10］。由于糞腸球菌TLME3株能引起雛鵝敗血性疾病，造成高達(dá)30%～50%的病鵝死亡；致病性試驗(yàn)中，小鼠各組死亡率總和為2．33，LD50為10－1．6229［11］。如果其AceA蛋白具有免疫活性，將其作為雛鵝糞腸球菌性敗血癥疫苗和診斷生物制劑的候選蛋白，有重要的研究價(jià)值。

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